[发明专利]PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用

说明书

本发明提供PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用，属于分子生物学和病毒学领域。构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，包括如下步骤：以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模板，扩增6片段，分别插入载体pSMART中，然后将位置不合适的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变；将各重组载体酶切，回收目标的cDNA片段，连接后得到所述PEDV JS2008株全长感染性cDNA。本发明PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法，该方法巧妙，效率高，可以应用于拯救猪流行性腹泻病毒，以研究PEDV致病机制及新型疫苗。

技术领域

本发明属于分子生物学和病毒学领域，具体涉及PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是一种急性、高度传播性疾病，引起该病的主要病原为猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)。该病以呕吐、水样腹泻、脱水及代谢性酸中毒等为主要临床特征。各年龄阶段的猪均易感，但若影响哺乳仔猪，发病率为100％，死亡率高达80％-100％。国际病毒分类委员会将PEDV划归为套式病毒目、冠状病毒亚科、alpha-冠状病毒属。Alpha冠状病毒的其他成员还有Alphacoronavirus 1(包括猫冠状病毒、TGEV和犬冠状病毒等)、人冠状病毒NL63、人冠状病毒229E、长翼蝠冠状病毒HKU8、长翼蝠冠状病毒1、黄蝠冠状病毒512和菊头蝠冠状病毒HKU2。

PEDV是有囊膜、不分节段、单股正链RNA病毒，到目前为止超过一百个毒株的全基因组被测序完成，不同毒株基因组大小不等，全长约为28kb，包含5’cap结构和3’poly A尾。PEDV全基因组由5’端非编码区、3’UTR和至少7个开放阅读框(Open reading fram，ORF)组成，编码3个非结构蛋白(复制酶1a、1b及非结构蛋白ORF3)和4个结构蛋白(S、E、M和N)，它们在基因组的顺序为5’UTR-P1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR。ORF3是一个位于结构基因S和E之间的非结构基因，该类基因在不同的冠状病毒中的数目和大小均不同。

现有技术中，缺乏用于研究PEDV JS2008株致病机制的全长感染性cDNA和有效疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法，该方法巧妙，效率高。

本发明的另一目的是提供PEDV JS2008株全长感染性cDNA。

本发明的再一目的是提供PEDV JS2008株全长感染性cDNA的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，包括如下步骤：

(1)以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模板，采用引物A-1-F和A-4997-R扩增PEDV-A片段，采用引物B-4971-F和B-11100-R扩增PEDV-B片段，采用引物C-11073-F和C-16216-R扩增PEDV-C片段，采用引物D-16194-F和D-19726-R扩增PEDV-D片段，采用引物E-19702-F和E-24860-R扩增PEDV-E片段，采用引物F-24832-F和F-27954-R扩增PEDV-F片段；

(2)将步骤(1)PCR扩增获得的6片段，分别插入载体pSMART中，得到插入了PEDV-A片段的重组载体pS-A、插入了PEDV-B片段的重组载体pS-B、插入了PEDV-C片段的重组载体pS-C、插入了PEDV-D片段的重组载体pS-D、插入了PEDV-E片段的重组载体pS-E、插入了PEDV-F片段的重组载体pS-F；