[发明专利]一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的制备方法与应用

权利要求书

1.一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的制备方法与应用，其特征在于：制备方法在于以下具体步骤：

（1）氯吡脲半抗原的合成：在无水三氯化铝的催化作用下，氯吡脲与丁二酸酐发生傅克反应，在氯吡脲的苯环上引入活性基团羧基和连接臂，得到半抗原，即氯吡脲半抗原；

（2）氯吡脲全抗原的合成：采用碳二亚酰法将氯吡脲半抗原与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫全抗原；

（3）多克隆抗体的制备：用合成的全抗原免疫动物，取血，离心得到抗血清，即为氯吡脲多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的制备方法与应用，其特征在于：所述的动物优选为新西兰大白兔。

3.如权利要求1所述的一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的制备方法与应用一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的制备方法与应用，其特征在于：具体的步骤如下：

（1）氯吡脲半抗原的合成

采用无水二甲基甲酰胺（DMF）做溶剂，氯吡脲（2.48 g）、丁二酸酐（1 g）、无水三氯化铝（6.68 g）按1：1：5的摩尔比进行投料，将DMF（2 mL）逐滴加入到装有无水三氯化铝的烧瓶中，不断搅拌使其充分溶解，待瓶口不再有白雾冒出时放入油浴（200℃）中，把氯吡脲和丁二酸酐的混合物加入到烧瓶中，反应2 h后，把反应液慢慢倒入90 mL冰水中，加6 mL浓度为12 mol/L的浓盐酸，冷却静置后过滤水洗，得到粗品，再用DMF/甲醇对粗品进行重结晶纯化，得到淡粉色固体物质，即为氯吡脲半抗原（CPPU-COOH）；

（2）氯吡脲免疫抗原的合成

准确称取CPPU-COOH 3.48 mg溶于200 μL DMF中，加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 1.38 mg（另溶于200 μL DMF），再加入2.88 mg溶解好的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）（另溶于300 μL DMF），室温下振荡反应12 h，得到溶液1；称取6.8 mg BSA溶于2 mL 1×PBS中，得到溶液2，再将溶液1逐滴加入溶液2中，边加边振荡，冰浴振荡反应12 h，反应混合物移入处理好的透析袋中，用超纯水透析3 d，每天换3次透析液，即得到氯吡脲免疫抗原（CPPU-BSA），-20℃保存备用；

（3）氯吡脲检测抗原的制备称取CPPU-COOH 3.48 mg溶于200 μL DMF中，加入NHS 3.45 mg（溶于200 μL DMF），再直接加入2.88 mg EDC（另溶于300 μL DMF），室温振荡反应12 h，得到溶液3；称取4.5 mg 卵清蛋白（OVA）溶于1.8 mL 1×PBS中，得到溶液4，将溶液3与溶液4混匀后，冰浴振荡反应12 h反应混合物移入处理好的透析袋中，用超纯水透析3 d，每天换3次透析液，即得到氯吡脲检测抗原（CPPU-OVA），-20℃保存备用；

（4）抗氯吡脲多克隆抗体的制备

用得到的氯吡脲免疫抗原对体重为1.5~2.5 kg的新西兰大白兔进行免疫，每次免疫剂量均为200-300 μg/只，第一次免疫采用弗氏完全佐剂与等体积的免疫抗原混合后乳化，皮下注射8~10个部位，之后每间隔3周加强免疫一次，加强免疫采用弗氏不完全佐剂与等体积抗原乳化后背部皮下免疫5个点外，增加注射两个肌肉位点，从第3次加强免疫开始，在免疫后的第七天耳缘静脉取血，检测抗血清的效价和特异性，当抗体的效价和特异性达到要求后，颈动脉采血，离心后获得抗血清，-20℃保存。

4.一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的应用，其特征在于：氯吡脲多克隆抗体在检测水果中氯吡脲的应用。

5.如权利要求4所述的一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的应用，其特征在于：应用抗氯吡脲多克隆抗体检测脐橙中氯吡脲残留量的间接竞争酶联免疫方法具体如下：

1、样品前处理

称取10 g已匀浆好的脐橙样品于50 mL离心管中，再加入1 g氯化钠固体，20mL乙腈，涡旋震荡两分钟，将离心管置于冷水浴中冷却，缓慢加入6 g无水硫酸镁，用玻璃棒充分混匀搅拌，涡旋震荡，于4000 r/min离心5min；移取2 mL上清液于15 mL离心管中，再加入100 mgN-丙基乙二胺（PSA），100 mg C18，30 mg活性炭和100 mg无水硫酸镁，涡旋震荡2分钟，于4000 r/min离心5 min，准确移取1 mL上清液于10 mL离心管中，氮气吹干，用含10%甲醇1×PBS(pH=6)缓冲溶液定容至1 mL，即可进行酶联免疫测定；

2、间接竞争酶联免疫法

采用方正滴定法优化了检测抗原的最佳包被浓度，同时对ELISA条件中的氯吡脲标准溶液中有机溶剂浓度、抗血清稀释液的离子强度和pH值进行了优化，确定了最佳工作条件，具体如下：

(1)抗原包被：用1×PBS稀释检测抗原到浓度为2 ug/mL，按照 100 μL/孔加入到 96孔酶标板孔中，做好标记，4 ℃ 湿盒过夜；

（2）封闭：倾去反应液，PBST 洗涤液洗涤三次，取封闭液（ 1×PBS 含 5％脱脂奶粉）以 150 μL/孔加入酶标板孔， 37 ℃ 湿盒孵育1.5小时；

（3）一抗反应：倾去封闭液，用PBST 洗涤液洗涤三次，在每孔中先加入50 μL 1×PBS缓冲液，再加入50 μL氯吡脲标准溶液或样品溶液，然后加入50 μL 1:80000稀释的抗氯吡脲多克隆抗体工作液，稀释液为10×PBS缓冲液，pH=6.0，同时设置空白对照为PBS，37 ℃保湿温育45 min；

（4）二抗反应：倾去反应液，PBST 洗涤液洗涤三次，每孔加入 200μL的1：10000的HRP-羊抗兔 IgG 二抗，37℃ 湿盒孵育1小时；

（5）底物显色反应：倾去反应液，PBST 洗涤液洗涤三次，每孔加入TMB底物显色液 150 μL，室温反应20分钟；

（6）终止反应：往酶标板孔中加入终止液（2N H₂SO₄），50 μL/孔；

（7）测定：把酶标板正确放置在酶标仪上，检测每孔在 450nm处吸光值OD_450nm值。