[发明专利]一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的制备方法与应用，属于植物生长调节剂小分子化合物免疫化学和食品安全分析领域。

背景技术

氯吡脲是一种高活性的植物生长调节剂，具有加速细胞有丝分裂、促进细胞的增大和分化、防止落花落果、促进果实膨大等作用，常用于脐橙、柑桔、猕猴桃、葡萄、西瓜、黄瓜等果蔬的农业生产中。残留于果蔬中的氯吡脲可能会对人类及其他生物造成潜在的威胁，美国环保署在《农药毒性确认和管理》中指出，长期接触氯吡脲会引起体内蛋白质代谢的紊乱，造成肺气肿和体型消瘦。各国制定对食品中氯吡脲的最大残留限量不同，范围为0.01～0.1 mg/kg，如澳大利亚规定猕猴桃中氯吡脲的最大残留限量为0.01 mg/kg，美国为0.04 mg/kg，欧盟为0.05 mg/kg，日本为0.1 mg/kg。我国食品安全国家标准GB2763-2014（食品中农药最大残留限量）规定食品中氯吡脲最大残留限量为黄瓜、西瓜、甜瓜≤0.1 mg/kg，猕猴桃、葡萄、橙、枇杷≤0.05 mg/kg。

氯吡脲残留检测目前主要采用液相色谱法、气相色谱法或质谱分析方法等技术，存在检测成本高、周期长及操作繁琐复杂等问题，不适合大规模现场筛查，因此迫切要求发展简便、灵敏、特异性强、成本低廉的快速检测技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的制备方法，及提供抗氯吡脲多克隆抗体在检测氯吡脲中的应用。

一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的制备方法，是通过以下技术实现的：

（1）氯吡脲半抗原的合成：在无水三氯化铝的催化作用下，氯吡脲与丁二酸酐发生傅克反应，在氯吡脲的苯环上引入活性基团羧基和连接臂，得到半抗原，即氯吡脲半抗原；

（2）氯吡脲全抗原的合成：采用碳二亚酰法将氯吡脲半抗原与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫全抗原；

（3）多克隆抗体的制备：用合成的全抗原免疫动物，取血，离心得到抗血清，即为氯吡脲多克隆抗体。

所述的动物优选为新西兰大白兔，利用上述方法制备的兔多克隆抗体

一种氯吡脲人工抗原和多克隆抗体的制备方法，具体的步骤如下：

1、氯吡脲半抗原的合成

采用无水二甲基甲酰胺（DMF）做溶剂，氯吡脲（2.48 g）、丁二酸酐（1 g）、无水三氯化铝（6.68 g）按1：1：5的摩尔比进行投料。将DMF（2 mL）逐滴加入到装有无水三氯化铝的烧瓶中，不断搅拌使其充分溶解，待瓶口不再有白雾冒出时放入油浴（200℃）中。把氯吡脲和丁二酸酐的混合物加入到烧瓶中，反应2 h后，把反应液慢慢倒入90 mL冰水中，加6 mL浓度为12 mol/L的浓盐酸，冷却静置后过滤水洗，得到粗品，再用DMF/甲醇对粗品进行重结晶纯化，得到淡粉色固体物质，即为氯吡脲半抗原（CPPU-COOH）；

2、氯吡脲免疫抗原的合成

准确称取CPPU-COOH 3.48 mg溶于200 μL DMF中，加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 1.38 mg（另溶于200 μL DMF），再加入2.88 mg溶解好的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）（另溶于300 μL DMF），室温下振荡反应12 h，得到溶液1；称取6.8 mg BSA溶于2 mL 1×PBS中，得到溶液2。再将溶液1逐滴加入溶液2中，边加边振荡，冰浴振荡反应12 h。反应混合物移入处理好的透析袋中，用超纯水透析3 d，每天换3次透析液，即得到氯吡脲免疫抗原（CPPU-BSA），-20℃保存备用；

3、氯吡脲检测抗原的制备

称取CPPU-COOH 3.48 mg溶于200 μL DMF中，加入NHS 3.45 mg（溶于200 μL DMF），再直接加入2.88 mg EDC（另溶于300 μL DMF），室温振荡反应12 h，得到溶液3；称取4.5 mg 卵清蛋白（OVA）溶于1.8 mL 1×PBS中，得到溶液4。将溶液3与溶液4混匀后，冰浴振荡反应12 h。反应混合物移入处理好的透析袋中，用超纯水透析3 d，每天换3次透析液，即得到氯吡脲检测抗原（CPPU-OVA），-20℃保存备用；

4、抗氯吡脲多克隆抗体的制备