[发明专利]生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1;3-丙二醇生产中的应用

说明书

本发明提供了生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3‑丙二醇生产中的应用。通过基因工程方法构建出强化tqsA基因表达的变栖克雷伯氏菌TqsA，并通过发酵工艺优化提供一种采用变栖克雷伯氏菌F2R9^T及变栖克雷伯氏菌TqsA发酵甘油生产1,3‑丙二醇的方法。本发明首次提供采用克雷伯氏菌F2R9^T发酵甘油生产1,3‑丙二醇，并通过基因工程手段构建出强化tqsA基因表达的变栖克雷伯氏菌TqsA从而强化1,3‑丙二醇的生产；采用本发明优化的发酵工艺能够使克雷伯氏菌F2R9^T生产1,3‑丙二醇的产率达到72g/L，且变栖克雷伯氏菌TqsA发酵甘油生产1,3‑丙二醇的产率达到85g/L，为1,3‑丙二醇的微生物发酵生产提供了生物安全的菌种及其高效生产1,3‑丙二醇的工艺。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用。

背景技术

1,3-丙二醇用途广泛，是非常重要的化工产品及平台化合物，可用作粘合剂、保护剂、润滑剂、抗冻剂及溶剂，在高分子材料、医药、化工、食品及化妆品领域都具有广泛应用。其最重要的用途为生产聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT的良好特性，包括水洗性、延展性及回复性都使得其市场需求日益扩大。由此拉动了1,3-丙二醇的市场需求(Liu H.et al.,Biotechnol J.2010,5(11):1137–1148)。

鉴于1,3-丙二醇的重要作用，化学法合成的种种弊端，利用微生物发酵甘油生产1,3-丙二醇的研究备受关注。目前报道的合成1,3-丙二醇的菌株主要有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、梭菌属、肠杆菌属以及乳酸菌属。其中，克雷伯氏菌属的菌株属于兼性厌氧菌，在工业应用中容易培养，且该类菌株具有良好的底物甘油耐受性及产物1,3-丙二醇耐受性，1,3-丙二醇的生产强度和转化率较高。因此，克雷伯氏菌属是研究较多的优良的1,3-丙二醇生产菌株。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)是目前研究较多，且1,3-丙二醇生产性能较好的菌株。

CN103740609B公开了一株高产1,3-丙二醇克雷伯肺炎杆菌(即：肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae)，其于2013年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.7824，保藏名称为ACR30；该肺炎克雷伯氏菌ACR30在5L发酵罐批次流加发酵实验中，发酵72小时1,3-丙二醇浓度达到116g/L。

另有一篇文章报道过一株乳酸生产途径缺陷的产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，以及该菌株在微好氧条件下发酵生产1,3-丙二醇的应用。作者通过对产酸克雷伯氏菌M5al的乳酸脱氢酶基因进行了插入失活，获得了突变菌株产酸克雷伯氏菌LDH3。在7.5L发酵罐中，微好氧条件下，产酸克雷伯氏菌LDH3发酵甘油和糖的混合碳源(80％甘油、10％糖和10％水)，可生产83.56g/L的1,3-丙二醇，1,3-丙二醇的转化率为0.62mol/mol，1,3-丙二醇生产强度为1.61g/L h(Yang,G.,Tian,J.,&Li,J.(2007).Fermentation of 1,3-propanediol by a lactate deficient mutant of Klebsiella oxytoca undermicroaerobic conditions.Applied Microbiology and Biotechnology,73(5),1017-1024.)。

然而，上述两类菌株均为条件致病菌，即生物安全2类菌。条件致病菌在工业应用中存在着较多限制及安全隐患，该类菌株生产的产品的应用范围受到严重限制(CelińskaE.Crit Rev Biotechnol.2012,32(3):274–288)。