[发明专利]一种2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠的合成方法

说明书

本发明公开了一种流感病毒神经酰胺酶荧光底物2‑(4’‑甲基伞形酮)‑alpha‑N‑乙酰基神经氨酸钠的合成方法：以N‑乙酰基神经氨酸为起始原料，得到苄酯，然后2位上引入离去基团‑Cl，其余位点用乙酰基保护，2位与4‑甲基伞形酮偶联，最后脱乙酰基和苄酯保护得到目标钠盐产品。本发明采用苄酯中间体比甲酯更容易生成单一构型，更利于析晶提纯；采用冰醋酸/乙酰氯代替吡啶/乙酸酐先得到全乙酰化中间体，反应过程中2位上的乙酰基被‑Cl取代成为为更好的离去基团。本发明可以大量低成本快速制备2‑(4’‑甲基伞形酮)‑alpha‑N‑乙酰基神经氨酸钠，作为开发流感病毒检测试剂盒的关键原料。

技术领域

本发明涉及一种神经酰胺酶荧光底物的合成方法，具体涉及一种流感病毒神经酰胺酶荧光底物2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠的合成方法。

背景技术

流感是发病率高、传播快、致病地域最广的传染性疾病之一，快速检测流感病毒技术对制定预防措施及指导早期使用抗病毒药物起着关键性的作用。现有常规的流感病毒的分离培养、血清检测等流感病毒的检测方法存在耗时长、灵敏度滴等缺陷。神经氨酸酶(NA)对A型和B型的流感病毒复制有重要作用，检测该酶的活性为快速检测流感病毒提供了新的方法。专利US 2014272942 A1 Methods of deteting influenza virus中公开了2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠可以通过荧光检测方法，在数小时内检测出流感病毒的存在和种类结果，具有特异性强、敏感度高、实时监测等优点，在爆发疫情的应急检测中具有很高的应用价值。2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠作为流感病毒神经酰胺酶的底物可以快速灵敏的检测流感病毒，也可以快速确定抗流感药物的病毒抑制效果，有效的筛选出有效的抗病毒药物。其原理在于，神经氨酸酶分解该底物，使其裂解释放出一个荧光化合物——4-甲基伞形酮，根据荧光强度可以测得神经氨酸酶的活性，确定流感病毒是否存在或者所设计的药物抗病毒抑制的效果。

荧光反应机理：

然而，关于此化合物的合成方法报道较少。Thomas G.等，报道了以N-乙酰基神经氨酸为起始原料，最终通过2-deoxy-2-chloro-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-N-acetylneuraminic acid methyl ester与7-羟基-4-甲基香豆素钠合成2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸(Synthesis of 2'-(4-methylumbelliferyl)-alpha-D-N-acetylneuraminic acid and detection of skin fibroblast neuraminidase innormal humans and in sialidosis.Biochemistry,1979,18(13),pp 2783-2787)，该反应过程收率低、成本高，不适于工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种合成步骤简单、成本低廉的神经酰胺酶荧光底物2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠盐的合成方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种2-(4’-甲基伞形酮)-alpha-N-乙酰基神经氨酸钠盐的合成方法，包括以下步骤：

(1)N-乙酰基神经氨酸溶于适量水中，加入碳酸铯溶液至溶液呈弱碱性，减压蒸馏除水得到固体N-乙酰基神经氨酸铯。N-乙酰基神经氨酸铯溶于适当溶剂，滴加溴化苄反应一段时间，过滤，滤液减压蒸馏得油状物，在适当溶剂中结晶，得化合物1；

(2)将化合物1溶于冰醋酸中，滴加乙酰氯，TLC跟踪反应完全后，加入共沸溶剂减压蒸馏得油状物，即化合物2；

(3)将化合物2溶于溶剂中，加入4-甲基伞形酮，减压蒸馏脱溶后，剩余物过硅胶柱，洗脱液脱溶得固体化合物3；