[发明专利]一种制备稀有人参皂苷的酶组合物及其应用

权利要求书

1.酶组合物在制备稀有人参皂苷C-K的方法，其特征在于步骤为：取人参皂苷Rb2、Rc和Rb3的浓度均为2mM，转化条件为85℃，pH 5.0 50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，通过HPLC-ELSD进行检测；添加β-葡萄糖苷酶Dth3至于0.64 U/mL后在60 min内将人参皂苷Rb2、Rc和Rb3转化为稀有人参皂苷C-Y、C-Mc和C-Mx；取人参皂苷C-Y、C-Mc和C-Mx的浓度均为2mM，转化条件为85℃，pH 5.0 50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，通过HPLC-ELSD进行检测，添加β-半乳糖苷酶Tpegal至10U/mL 、添加α-阿拉伯呋喃糖苷酶TthFase至1.2 U/mL和添加β-木糖苷酶Tpexyl至1U/mL后，在60 min内将相应人参皂苷底物转化为稀有人参皂苷C-K；

所述酶组合物由β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和β-木糖苷酶组成，所述β-葡萄糖苷酶为来源于Dictyoglomus thermophilum DSM 3960 β-葡萄糖苷酶Dth3；具体制备方法为：Dictyoglomus thermophilum购于DSMZ菌种保藏中心编号为DSM3960；

其培养基配方为：10 g/L可溶性淀粉，3 g/L酵母粉，5 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 肉浸液，10 g/L 2-吗啉乙磺酸，10 mg/L 七水合硫酸铁，1 mg/L 刃天青，调pH为7.2，煮沸冲氮气，除去氧气后，培养基在无氧条件下装入厌氧瓶灭菌；用注射器按照0.5%接种量接种，85℃静止培养24 h，收集细胞；静置培养Dictyoglomus thermophilum 24 h，取30 mL菌液4,000 g离心10 min收集细胞；用9.5 mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5 mL 10％十二烷基硫酸钠和50 μL20 mg/mL蛋白酶K，混合均匀，37℃保温1 h；加入1.8 mL 5 mol/L NaCl，1.5 mL 十六烷基三乙基溴化铵/NaCl，混匀，65℃温育20 min；加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000 g离心10 min；为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6000 g离心10 min；另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见；用吸管将DNA缠绕其上，在70％酒精中清洗；用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5 mL离心管中；室温下风干，加500 μL TE 缓冲液溶解；取50 μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度；按照已知的Dictyoglomus thermophilum极耐热β-葡萄糖苷酶基因Dth_1949设计引物，并去除终止密码子；以提取的Dictyoglomus thermophilum的基因组DNA为模板，用合成的引物P1: CTAGCTAGCGCACTTAAATACAGGTTTCCTGA; P2: ATTTGCGGCCGCTTATTTAAGAAACTCTTTCTCCATCTC进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，3min；30次循环，每次循环流程为 94℃，10 s；58℃，30 s；72℃，2 min50s；72℃，10 min；反应停止，4℃保温；通过凝胶回收试剂盒对 PCR 扩增产物进行纯化；得到Dictyoglomus thermophilum极耐热β-葡萄糖苷酶基因；获得的Dictyoglomus thermophilum极耐热β-葡萄糖苷酶基因和pET-28a分别用Nco I和Not I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，转化产物涂布到添加卡那霉素至终浓度50 mg/L 的LB固体培养基上37℃过夜培养，接种几个单菌落到添加卡那霉素至终浓度50 mg/L的 LB液体培养基中培养8-10小时后，收集菌体提取质粒，酶切验证去除空载质粒，将重组质粒进行核酸序列测定，得到正确的重组表达载体pET20b-bgl；重组极耐热β-葡萄糖苷酶Dth3的表达及纯化：将重组质粒pET-20b-bgl转化大肠杆菌BL21DE3宿主菌，在含有50 μg/mL Kana的LB平板上经过37℃培养过夜，所述LB平板为胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 15 g/L；挑转化子到200 mL的100 μg/mL Amp的 LB培养基中，37℃，200 rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.5 mM 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，30℃诱导培养8 h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13000 rpm离心15min，收集菌体，去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，随后70℃热处理30 min，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13000 rpm离心15 min，上清即为重组极耐热β-葡萄糖苷酶的纯酶；

所述β-半乳糖苷酶为来源于Thermotoga petrophila DSM13995 β-半乳糖苷酶Tpegal，且Tpegal具有α-阿拉伯吡喃糖苷酶活性；具体制备方法为：Thermotoga petrophila购于DSMZ菌种保藏中心编号为DSM 13995，其培养基配方为：10 g/L可溶性淀粉，3 g/L酵母粉，5 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 肉浸液，10 g/L 2-吗啉乙磺酸，10 mg/L 七水合硫酸铁，1 mg/L 刃天青，调pH为7.2，煮沸冲氮气，除去氧气后，培养基在无氧条件下装入厌氧瓶灭菌；用注射器按照0.5%接种量接种，85℃静止培养24 h，收集细胞；静置培养Thermotoga petrophila 24 h，取30 mL菌液4,000 g离心10 min收集细胞；用9.5 mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5 mL 10％十二烷基硫酸钠和50 μL 20 mg/mL蛋白酶K，混合均匀，37℃保温1 h；加入1.8 mL 5 mol/L NaCl，1.5 mL 十六烷基三乙基溴化铵/NaCl，混匀，65℃温育20 min；加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000 g离心10 min；为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6000g离心10 min；另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见；用吸管将DNA缠绕其上，在70％酒精中清洗；用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5mL离心管中；室温下风干，加500 μL TE 缓冲液溶解；取50 μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度；按照已知的Thermotoga petrophila极耐热β-葡萄糖苷酶基因Tpe_1557设计引物，并去除终止密码子；以提取的Thermotoga petrophila的基因组DNA为模板，用合成的引物P3:CCCATATGCTCGGAGTCTGTTACTATCCT ;P4: CGCTCGAGGTGTTCGTTTTCCCTCCATATC进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，3 min；30次循环，每次循环流程为94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，1min30s；72℃，10 min；反应停止，4℃保温；通过凝胶回收试剂盒对 PCR 扩增产物进行纯化，得到Thermotoga petrophila极耐热β-葡萄糖苷酶基因；得到Thermotoga petrophila极耐热β-葡萄糖苷酶基因和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，转化产物涂布到氨苄青霉素至终浓度100 mg/L的LB固体培养基上37℃过夜培养，接种几个单菌落到氨苄青霉素至终浓度100 mg/L的LB液体培养基中培养8-10小时后，收集菌体提取质粒，酶切验证去除空载质粒，将重组质粒进行核酸序列测定，得到正确的重组表达载体pET20b-gal；将重组质粒pET-20b-gal转化大肠杆菌BL21DE3 宿主菌，在含有100 μg/mL Amp的LB平板上经过37℃培养过夜，所述LB平板为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 15 g/L；挑转化子到200 mL 100 μg/mL Amp 的LB培养基中，37℃，200 rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.5 mM 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，30℃诱导培养8 h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13000 rpm离心15 min，收集菌体，去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，随后70℃热处理30 min，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13000 rpm离心15 min，上清即为重组极耐热β-半乳糖苷的纯酶；所述α-阿拉伯呋喃糖苷酶为来源于Thermotoga thermarum DSM 5069 α-阿拉伯呋喃糖苷酶TthFase；具体制备方法为：Thermotoga thermarum DSM 5069购于DSMZ菌种保藏中心，编号为：DSM 5069，其培养基配方为：5 g/L可溶性淀粉，1 g/L酵母粉，1.5 g/L KH₂PO₄，4.2 g/L Na₂HPO₄ x 12H₂O，3.4 g/LNaCl，1 g/L MgSO₄ x 7H₂O，0.76 g/L EDTA，1 mL/L微量元素，0.5 g/L Na₂S·9H₂O，0.5 g/L Cysteine HCl，1 mg/L 刃天青，调pH为7.0，煮沸冲氮气，除去氧气后，培养基在无氧条件下装入厌氧瓶灭菌，微量元素 1000×配方：FeCl₃ 2.0 g/L；H₃BO₃ 0.05 g/L；ZnCl₂ 0.05g/L；CuCl₂·2H₂O 0.03 g/L；MnCl₂·4H₂O 0.05g/L；(NH₄)₂MoO₄ 0.05g/L；AlKSO₄·2H₂O0.05g/L，用注射器按照0.5%接种量接种，82℃静止培养24 h，收集细胞；静置培养Thermotoga thermarum DSM 5069 24 h，取30 mL菌液4000 g离心10 min收集细胞；用9.5mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5 mL 10％十二烷基硫酸钠和50 μL20 mg/mL蛋白酶K，混合均匀，37℃保温1 h；加入1.8 mL 5 mol/L NaCl，1.5 mL 十六烷基三乙基溴化铵/NaCl，混匀，65℃温育20 min；加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6000 g离心10 min；为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6000 g离心10 min；另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见；用吸管将DNA缠绕其上，在70％酒精中清洗，用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5 mL离心管中；室温下风干，加500 μL TE 缓冲液溶解；取50 μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度；按照已知的Thermotoga thermarum DSM 5069极耐热阿拉伯呋喃糖苷酶基因WP 013932416.1设计引物，并去除终止密码子；以提取的Thermotoga thermarum DSM 5069的基因组DNA为模板，用合成的引物P5: ATGCCATGGCTTACGAAATCAGTGTGAATC；P6:CCGCTCGAGTGATCTTTCTACTTCTATCAC进行PCR扩增，扩增的条件是94℃，3 min；30次循环，每次循环流程为94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，1 min30s；72℃，5 min；反应停止，4℃保温；通过凝胶回收试剂盒对 PCR 扩增产物进行纯化，得到Thermotoga thermarum DSM 5069极耐热阿拉伯呋喃糖苷酶基因；得到Thermotoga thermarum DSM 5069极耐热阿拉伯呋喃糖苷酶基因和pET-28a分别用Nco I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有极耐热糖苷酶基因的重组质粒pET-28a-Arf；将重组质粒pET-28a-Arf转化大肠杆菌BL21DE3 宿主菌，在含有Kan50 μg/mL的LB平板上经过37℃培养过夜，所述LB平板配方为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 15 g/L；挑转化子到200 mL 50 μg/mL Kan的LB培养基中，37℃，200 rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.01 mM 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，30℃诱导培养8 h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13000 rpm离心15 min，收集菌体，去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，随后70℃热处理30 min，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13000rpm离心15 min，上清即为重组极耐热阿拉伯呋喃糖苷酶的纯酶；

所述β-木糖苷酶为来源于Thermotoga petrophila DSM13995 β-木糖苷酶TpeXyl；具体制备方法为：按照已知的Thermotoga petrophila极耐热β-葡萄糖苷酶基因Tpe_0848设计引物，以提取的Thermotoga petrophila的基因组DNA为模板，用合成的引物P7：CATGCCATGGAACTGTACAGGGATCCTTCG；P8：CCGCTCGAGCTCCTCGCAGGCTTCCGTGAA进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，3 min；30次循环，每次循环流程为94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，1min30s；72℃，10 min；反应停止，4℃保温；通过凝胶回收试剂盒对 PCR 扩增产物进行纯化，得到Thermotoga petrophila极耐热β-葡萄糖苷酶基因；得到Thermotoga petrophila极耐热β-葡萄糖苷酶基因和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，转化产物涂布到卡那霉素至终浓度50 mg/L的LB固体培养基上37℃过夜培养，接种几个单菌落到卡那霉素至终浓度50 mg/L的LB液体培养基中培养8-10小时后，收集菌体提取质粒，酶切验证去除空载质粒，将重组质粒进行核酸序列测定，得到正确的重组表达载体pET28a-xyl；将重组质粒pET28a-xyl转化大肠杆菌BL21DE3宿主菌，在含有50 μg/mL kana的LB平板上经过37℃培养过夜，所述LB平板配方为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 15 g/L；挑转化子到200 mL 100 μg/mL Amp的LB培养基中，37℃，200 rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6时，加入终浓度为0.5 mM 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，30℃诱导培养8 h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13000 rpm离心15 min，收集菌体，去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，随后70℃热处理30 min，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13000 rpm离心15 min，上清即为重组极耐热β-木糖苷的纯酶。