[发明专利]一种制备稀有人参皂苷的酶组合物及其应用

说明书

一种制备稀有人参皂苷的酶组合物及其应用，应用于转化多组分人参皂苷制备人参皂苷C‑K等稀有人参皂苷。其特征在于一种嗜热菌来源能够一次性切除人参皂苷母核3位上两个糖基的β‑葡萄糖苷酶，获得稀有组分C‑Y、C‑Mc和C‑Mx，其摩尔转化率均高于96%。再一步，通过3种特异性的糖苷水解酶再分别切除前述三种产物各自20位外侧的阿拉伯吡喃糖、阿拉伯呋喃糖和木糖，获得最终产物稀有人参皂苷C‑K，摩尔转化率也均高于98%。本发明提供了一种新的稀有人参皂苷制备路线，并且能够同时高效转化多组分人参皂苷Rb2、Rc和Rb3获得稀有人参皂苷C‑K。

技术领域

本发明属于酶工程、保健品及生物医药领域，具体涉及一种制备稀有人参皂苷的酶组合物及其应用。

背景技术

人参是我国传统的名贵中药材，长期以来都被广泛地应用于抗疲劳和增强免疫力等方面，同时它具有生物活性广泛，药理作用独特等特点，特别是其显著的抗癌活性，抗衰老活性，使其日益成为关注的热点，然而其化学成分复杂，为其深入研究造成了障碍。随着现代医药分析技术的发展，人参的主要有效成分已被成功解析，其中主要成分人参皂苷被认为是人参主要的生物活性物质，进一步的研究表明在已分离鉴定的180余种人参皂苷单体里，5种糖基数量较多的皂苷(人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Re和Rg1)占总皂苷的80％以上，而药理活性更加优异的稀有人参皂苷(Rh1、Rh2、C-K、Rg2、F1和Rg3)含量很低，同时糖基数量较少。同时，有研究表明，人参皂苷的抗癌特性随着糖苷键数量的减少而有显著提高，特别是人参皂苷C-K及Rh2，其他糖基数量较少的稀有人参皂苷也具有更优异的药理活性。

稀有人参皂苷C-K具有抑制肿瘤细胞增殖、粘附侵袭和转移，促进肿瘤细胞的凋亡，提高机体免疫机能等生理作用，同时稀有人参皂苷C-Y、C-Mc和C-Mx同样具有优异的药理活性，具有开发成药及保健品的潜力。但稀有皂苷C-K在植物中含量很低，直接提取工艺复杂，成本太高，而稀有人参皂苷C-Y、C-Mc和C-Mx甚至无法直接从人参中提取得到。但人参皂苷Rb2和Rc是人参总皂苷中含量最高的几种人参皂苷、人参皂苷Rb3是三七叶人参皂苷中含量最高的组分。它们与稀有人参皂苷C-Y、C-Mc和C-Mx具有相似的母核结构，差别仅在于两端的糖基侧链(图1)。如果能选择性地切除Rb2、Rc和Rb3在3位上的糖基侧链和20位外侧的阿拉伯吡喃糖基和阿拉伯呋喃糖基及木糖基，就可以选择性地得到稀有人参皂苷C-Y、C-Mc、C-Mx和C-K。

目前，化学法和生物转化法都可以转化多组分人参皂苷生产稀有人参皂苷。其中生物转化法具有反应条件温和，特异性好等特点而倍受青睐。综合国内外的文献专利，目前转化人参皂苷多组分生成稀有人参皂苷的研究主要集中在多组分人参皂苷Rb1的转化上，如发明CN 103805581公布了一种β-糖苷酶突变体仅能将人参皂苷Rb1完全转化生产CK，产率仅为0.24g/L/h；发明CN 105296587也公布了一种来源于双歧杆菌的β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rb1生产CK，其转化率仅为68％；此外，有少部分专利涉及多组分人参皂苷Rb1、Rb2和Rc转化生成CK但均在实际应用方面存在一定局限性，如发明CN 105925654公布了一种复合酶联合杂多酸转化人参皂苷Rb1生产CK的方法，但其使用的催化剂杂多酸带有硅、钨、铁和锌等多种金属元素，对环境不友好，且涉及催化剂的失活问题、复合酶成分不明确，来源不稳定等问题，使得其工艺参数难以完全控制。而发明CN 104480127虽然也对人参皂苷Rb1、Rb2和Rc进行了转化并获得了CK，但其反应为分步水解人参皂苷母核不同位置上的多个糖基，因此其反应产物中存在多种中间产物，这为后续分离纯化带来了困难。因此，寻找能高效、特异性降解人参皂苷多组分生产稀有人参皂苷CK的糖苷水解酶成为了研究关键，同时选择的酶应具有相似或近似的最适反应pH和温度，能保证在相同的条件下均能较为高效地进行协同降解。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供了一种制备稀有人参皂苷的酶组合物及其应用。

技术方案：制备稀有人参皂苷的酶组合物，由β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和β-木糖苷酶组成。