[发明专利]一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法

权利要求书

1.一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

1）菌种预处理

从平板上挑取待测菌，所述待测菌直径2mm以上，加入至悬浮溶液A中，再进行机械粉碎破壁；悬浮溶液A为：100 mM Tris-HCl，25 mM EDTA，2.0 M NaC1，RnaseA 10ug/ml，pH 8.0；

2）准备高吸附力的柱子

取带过滤柱的离心管，加入吸附剂悬液S，离心处理，使吸附剂在过滤柱中形成斜面，舍弃滤液；吸附剂悬液S通过以下步骤制得：称取3g硅土至50ml三角瓶中，加20-30ml双蒸水，充分振摇，静置片刻，去上清，清洗3遍，加入双蒸水至2倍硅土体积，总体积约20ml，经高压灭菌后常温存放待用；

3）菌裂解和核酸吸附

加入裂解液L到步骤1）预处理后的菌液中，上下剧烈震荡，静置，离心，再取上清加入到步骤2）制好的吸附柱中，室温放置，离心，吸附柱离心时斜面一边朝外，舍弃滤液，收集管重新放回；裂解液L由以下组分混合得到：异硫氰酸胍30g、无菌水40ml、PH5.2的灭菌NaAc3ml、灭菌10% SDS 2.5ml、灭菌甘油2.5ml，总体积为50ml；

4）清洗

取步骤3）得到的上清液加入清洗液W，离心，清洗，每次倒掉收集管的滤液，最后一次甩15s后，吸附柱不再放回收集管，所述的清洗液W为浓度70%的酒精溶液；

5）洗脱

将吸附柱转移到新离心管中，滴上洗脱液E 10-15ul，盖紧盖子，保持60℃、5-10min，离心，收集到的滤液即为提取到的微量核酸溶液，所述的洗脱液E为灭过菌PH8.5的Tris溶液；

6）第一轮PCR扩增

取步骤5）得到的微量核酸溶液为模板，以引物SF1和SR1进行PCR扩增，引物SF1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，引物SR1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；第一轮PCR反应体积是15ul，10X Taq Buffer1.5ul，2.5 mM 的dNTP mixture 1.2ul， Taq 1u，10uM的引物各0.6ul，模板体积为5ul，剩余用纯水补足；PCR反应程序为：95℃ 300s，94℃ 15s，52℃ 45s，72℃ 45s，共35-40轮循环；72℃ 300s；

7）第二轮PCR扩增

取步骤6）得到的反应液的1/1000为模板，以引物MSF1、SR1和M13F进行PCR扩增，引物MSF1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，引物M13F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；反应体系为50-100ul，模板为第一轮反应产物的1/1000，其PCR为三引物PCR，其中引物MSF1的工作浓度为0.1uM，为正常PCR浓度的1/4，引物SR1的工作浓度为0.4 uM和引物M13F的工作浓度为0.4 uM；PCR反应程序为：95℃ 300s；94℃ 15s，52℃ 45s，72℃ 45s，共35-40轮循环；72℃ 300s；

8）电泳检测和纯化；

9）用引物M13F测序比对，确定属和种。

2.如权利要求1所述的一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法，其特征在于所述的步骤1）中机械粉碎破壁处理方法为以下任意一种：

a.在菌液中加入经灭菌后的3-5mm碳化钨圆珠1颗，置于沸水浴中5min后，在液氮速冻下，用往复式粉碎机研磨，研磨后，待恢复至常温；

b.在菌液中加入20ul体积预先处理过的0.1mm-1.5mm的玻璃珠，至于沸水浴中5min，待恢复至室温，漩涡震荡1min，玻璃珠处理方法为先将玻璃珠用清水清洗1-2遍，再用12N HCl浸泡过夜，随后漂洗干净，最后高压灭菌，烘干。

3.如权利要求1所述的一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法，其特征在于所述的步骤2）中带过滤柱的离心管是由离心柱铺上1-3层孔径1-10um的亲水微孔滤膜压紧得到。