[发明专利]一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法

说明书

一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法，属于生物技术领域。其包括以下步骤：1）菌种预处理；2）准备高吸附力的柱子；3）菌裂解和核酸吸附；4）清洗；5）洗脱；6）第一轮PCR扩增；7）第二轮PCR扩增；8）电泳检测和纯化；9）用引物M13F测序比对，确定属和种。本发明利用简易和高效的破壁和提取技术，再结合高效的核酸吸附技术，以及PCR的两次放大效应，可以在微生物菌落形成的初期，即能较为准确的鉴定菌，并且本发明用于鉴定的引物兼顾了真菌和细菌位点的统一性，不但对细菌能在种水平进行鉴定，对真菌也能够达属甚至种的水平，这样就方便了一些细菌和真菌的同时鉴定，大大提高了效率，节约了实验成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法。

背景技术

应用分子生物学手段开展菌种鉴定是当今微生物系统进化和分类鉴定的重要手段，例如利用细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列和真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列对分离到的菌种进行测定时，大都首先开展DNA的提取，再利用该DNA样品进行PCR扩增，最后通过PCR产物的测序以及序列比对，确定该菌的分类地位。现有检测手段在提取样品DNA时，通常需要菌的分离和培养，时间比较长，效率比较低，再加上有些菌只能在特定的条件下培养，常规培养并不容易，导致样品收集的困难。如果对样品进行少量的提取，又往往鉴定方法的敏感性不够而难以满足要求。如果简单地利用PCR放大机制来提高检测敏感性，对样品直接进行裂解后PCR，在理论上是可行的，而在实际操作过程中，却往往不易成功，特别是大部分的格兰氏阳性菌，放线菌和真菌，由于细胞壁比较厚，导致目标DNA难以收集到，而一些易扩增的极微量污染却容易混入反应中，从而使得最终扩增的结果往往是大量的假阳性。另外，由于细菌和真菌的分子鉴定区域有所差异，导致细菌和真菌需分开鉴定，带来了实验上的麻烦，特别是一些单细胞的真菌，有时与细菌会产生混淆，导致重复验证，大大降低了鉴定过程的效率，提高了检测成本。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法的技术方案。

所述的一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

1）菌种预处理

从平板上挑取待测菌，所述待测菌直径2mm以上，加入至悬浮溶液A中，再进行机械粉碎破壁；

2）准备高吸附力的柱子

取带过滤柱的离心管，加入吸附剂悬液S，离心处理，使吸附剂在过滤柱中形成斜面，舍弃滤液；

3）菌裂解和核酸吸附

加入裂解液L到步骤1）预处理后的菌液中，上下剧烈震荡，静置，离心，再取上清加入到步骤2）制好的吸附柱中，室温放置，离心，舍弃滤液，收集管重新放回；

4）清洗

取步骤3）得到的上清液加入清洗液W，离心，清洗，每次倒掉收集管的滤液，最后一次甩15s后，吸附柱不再放回收集管，所述的清洗液W为浓度70%的酒精溶液；

5）洗脱

将吸附柱转移到新离心管中，滴上洗脱液E 10-15ul，盖紧盖子，保持60℃、5-10min，离心，收集到的滤液即为提取到的微量核酸溶液，所述的洗脱液E为灭过菌PH8.5的Tris溶液；

6）第一轮PCR扩增

取步骤5）得到的微量核酸溶液为模板，以引物SF1和SR1进行PCR扩增，引物SF1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，引物SR1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

7）第二轮PCR扩增