[发明专利]一种微囊化hBMP-2/Tet-on系统的构建方法有效
| 申请号： | 201710686595.4 | 申请日： | 2017-08-11 |
| 公开（公告）号： | CN107557389B | 公开（公告）日： | 2021-02-23 |
| 发明（设计）人： | 白波;钱东阳;张姝江;杜秀藩;黄芳立;陈艺;姚咏嫦 | 申请（专利权）人： | 广州医科大学附属第一医院 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N5/10 |
| 代理公司： | 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 | 代理人： | 任重 |
| 地址： | 510120 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 微囊化 hbmp tet on 系统 构建 方法 | ||
1.一种微囊化hBMP-2/Tet-on系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.设计目的基因hBMP-2引物，PCR扩增、纯化后将目的基因hBMP-2定向克隆至携带Tet-on调控系统的GV347载体上，构建hBMP-2-GV347质粒；
S2.将hBMP-2-GV347质粒转化、扩增后，与辅助质粒共感染293T细胞；收集和浓缩慢病毒液，使用慢病毒载体转染293T细胞，得到含hBMP-2-GV347的慢病毒载体；
S3.使用含hBMP-2-GV347慢病毒载体转染BMSCs，得到hBMP-2-GV347-BMSCs；
S4.使用含酚基羧甲基纤维素作为微囊材料包裹hBMP-2-GV347-BMSCs；
其中，S4中酚基羧甲基纤维素微囊的粒径为80～160μm；
使用同轴共聚微流体制备酚基羧甲基纤维素微囊，酚基羧甲基纤维素微囊的制备方法为：使用液体共聚微流体装置和微量注射泵作为发生器，以液体石蜡作为外流体，含有酚基的羧甲基纤维素溶液作为内流体，将酚基羧甲基纤维素微囊先静置20～30min，待微囊完全沉积在收集管底部后，弃掉液体石蜡，加入PBS溶液，离心机上以2000rpm/min×5min离心洗涤；
S4中微囊包裹具体包括：选取hBMP-2-GV347-BMSCs 1×107/mL，消化成细胞悬液备用；分散相为0.1g酚基羧甲基纤维素，并溶解于4ml L-DMEM中，磁性搅拌30min直至完全溶解；加入1mg/mL的辣根过氧化物酶，充分溶解；微量泵上调整流速：延续相的用量为16mL/min；分散相的用量为50μL/min；反复离心，静置，洗涤。
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