[发明专利]一种微囊化hBMP-2/Tet-on系统的构建方法

说明书

本发明提供了一种微囊化hBMP‑2/Tet‑on系统的构建方法，包括如下步骤：S1.获取hBMP‑2基因，构建hBMP‑2‑GV347重组质粒；S2.将hBMP‑2‑GV347重组质粒转化、扩增后感染细胞，诱导，使用慢病毒载体进行包装，得到基因转染的BMSCs；S3.使用微胶囊包裹S2中得到的基因转染的BMSCs；本发明将Tet‑On系统与hBMP‑2同时构建于慢病毒载体上，可以提高两个系统的转染效率和表达，更加稳定和持续表达目的基因。转染BMSC后可以在强力霉素的作用下获得BMP‑2蛋白的稳定表达及促进BMSCs向成骨细胞分化。采用含酚基的羧甲基纤维素微囊进行包裹形成复合体，使上述系统在DOX的作用下，能稳定持续的向囊外分泌BMP‑2蛋白；停止使用DOX后，BMP‑2分泌即停止分泌。微囊中BMSCs细胞破囊后依然具备成骨分化能力，且可以在自分泌BMP‑2作用下成骨分化。

技术领域

本发明属于骨组织工程技术领域，涉及一种微囊化hBMP-2/Tet-on系统的构建方法。

背景技术

骨移植是治疗骨缺损、骨不连的金标准，目前临床上常用的骨移植材料包括自体骨、同种异体骨移植填充和组织工程骨。自体骨来源少，而异体骨费用昂贵，且有传播疾病、免疫排斥风险，都存在局限性。组织工程技术的发展为大段骨缺损的修复提供了新的方向。组织工程骨支架材料来源广泛，联合种子细胞可以促进骨再生。

形成骨组织的特殊物质骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)可诱导未分化的间充质细胞(mesenehymal osteoblast cell，BMSC)定向分化为骨细胞。其中，BMP-2是应用最广泛的成骨诱度因子，其诱导异位成骨高效、稳定。有研究发现加入了rhBMP-2的骨修复材料或过表达BMP-2的骨髓间充质干细胞在动物骨缺损模型中可以提高骨缺损的修复速度、增加骨小梁数目和骨皮质强度。这说明局部表达大量BMP能促进骨生成，短期体外提高BMP-2含量有利于治疗。但人体自身分泌BMPs量非常有限，且BMPs生物半衰期短，外源性注入的BMP-2，并不能使其维持有效浓度。所以利用基因重组技术导入BMP-2基因可使机体产生持续、稳定的内源性BMP-2蛋白，可促进骨组织修复。长期的BMP-2分泌存在一定的生物学风险，对在导入BMP-2基因的同时并控制它的表达成为一个难点。钱东阳等分别构建了包含hBMP-2目的基因和Tet-On系统的腺病毒载体，该系统共感染BMsCs后在低剂量DOX诱导下，hBMP-2呈现显著性表达。可选择的基因载体包括病毒载体和非病毒载体，非病毒载体无法将hBMP-2基因组整合至真核细胞基因组中。腺病毒的使用最广泛，但腺病毒经改良后，仍然残留病毒基因表达物的免疫反应和细胞毒性，对局部骨缺治疗带来不利因素。慢病毒(lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因载体，经历了第一代到第四代的发展，删除了大部分的致病基因，只保留了gag、pol和rev基因，病毒大部分转录失活，即使发生基因组重组，病毒也不可进一步复制扩散，使慢病毒作为载体的安全性大大增加。