[发明专利]一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法

权利要求书

1.一种基于碱基猝灭技术在单管中多位点单核苷酸多态性的检测用引物和探针组：

所述位点包括以下SNP位点：apoM rs707921、apoM rs707922和MCP-1 rs1024611；

所述apoM rs707921对应的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针为如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的3’端标记有FAM且5’端不进行标记的物质；

所述apoM rs707922对应的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针为如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的3’端标记有FAM且5’端不进行标记的物质；

所述MCP-1 rs1024611对应的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，探针为如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的3’端标记有ROX且5’端不进行标记的物质和如SEQID NO:8所示核苷酸序列的3’端标记有FAM且5’端不进行标记的物质；

所述引物和探针的制备和使用方法包括以下步骤：

1)采用不同的荧光基团分别标记不同的探针，得到不同荧光基团标记的探针；所述探针为单荧光标记的探针；所述不同的探针对应不同的单核苷酸位点；所述不同的单核苷酸位点对应不同的探针；不同的探针具有不同的Tm值；所述探针不依赖于鸟嘌呤；

2)将所述步骤1)得到的标记探针和靶基因混合置于同一反应体系中进行聚合酶链反应；所述聚合酶链反应的条件为：95℃预变性5min；95℃2s，58℃10s，60℃1min，共40个循环；

3)对所述步骤2)反应体系的荧光信号进行收集，得到熔解曲线，根据所述熔解曲线的Tm值的变化得到多位点单核苷酸多态性检测结果；所述熔解曲线根据所述收集到的荧光信号通过PCR熔解曲线分析程序得到；所述PCR熔解曲线分析程序的条件为：95℃30s，25℃4min，然后以0.1℃/s的温度转化率升温至80℃；

所述收集过程中，不同的荧光基团对应不同的荧光检测通道：

当用6-FAM标记apoM的两个SNP位点的探针，用ROX标记MCP-1的探针时，通过FAM和ROX通道收集每个循环的荧光数据，同时对apoMrs707921、apoM rs707922和MCP-1 rs1024611分型。