[发明专利]一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法

说明书

本发明涉及一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法，属于单核苷酸多态性检测技术领域。本发明提供的在单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法包括以下步骤：1)采用不同的荧光基团分别标记不同的探针，得到不同荧光基团标记的探针；所述不同的探针对应不同的单核苷酸位点；不同的探针具有不同的Tm值；2)将所述步骤1)得到的标记探针和靶基因混合置于同一反应体系中进行聚合酶链反应；3)对所述步骤2)反应体系的荧光信号进行收集，得到熔解曲线，根据熔解曲线的Tm值的变化得到多位点单核苷酸多态性检测结果。本发明提供的检测方法在单管中同时检测多个SNP位点，节省了时间，降低了成本，检测的准确度高，适合于大规模基因型筛选。

技术领域

本发明涉及单核苷酸多态性检测技术领域，具体涉及一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法。

背景技术

大约90％的人类基因变异都表现在DNA单个碱基的变化上，称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP的检测为致病基因的鉴定、药物靶向治疗的建立以及个体化给药提供了可能。因此，低成本、高效率、操作简便的检测SNP的新技术就显得尤为紧迫和重要。

近几年，以荧光基团标记的探针技术已经广泛用于快速的SNP基因分型。其中碱基猝灭技术是一种不依赖鸟嘌呤的单荧光标记的单探针技术，仅需要一对引物和一个探针，就可以实现SNP的筛查。研究表明碱基猝灭技术与DNA测序技术具有一致性，适合大规模的基因分型研究。目前，碱基猝灭探针技术已在单一荧光通道单管中成功完成了对多种基因的SNP位点的检测(如A1AT、线粒体DNA、MT2A基因、ABCC11、PROC基因、CYP4F2基因、EPHX1基因以及VKORC1基因等)。但是，该技术仅在单一荧光通道单管仅能检测1～2个SNP位点，具有很大的局限性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法。本发明提供的检测方法在单管中同时检测多个SNP位点，节省了时间，降低了成本，检测的准确度高，适合于大规模基因型筛选。

本发明提供了一种在单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

1)采用不同的荧光基团分别标记不同的探针，得到不同荧光基团标记的探针；所述不同的探针对应不同的单核苷酸位点；不同的探针具有不同的Tm值；

2)将所述步骤1)得到的标记探针和靶基因混合置于同一反应体系中进行聚合酶链反应；

3)对所述步骤2)反应体系的荧光信号进行收集，得到熔解曲线，根据所述熔解曲线的Tm值的变化得到多位点单核苷酸多态性检测结果；

所述收集过程中，不同的荧光基团对应不同的荧光检测通道。

优选的是，所述荧光基团包括：FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、Texas Red、ROX、CY3和CY5中的多个。

优选的是，不同探针所对应的Tm值独立地大于25℃。

优选的是，所述靶基因为基因组DNA。

优选的是，每25μL步骤2)的反应体系包括：10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂1.5μL，0.2mM 4×dNTPs 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，100μM前引物0.1μL，100μM后引物0.1μL，10μM标记探针各0.1μL，ddH₂O补足至25μL。

优选的是，所述步骤2)聚合酶链反应的条件为：95℃预变性5min；95℃2s，58℃10s，60℃1min，共40个循环。

优选的是，所述步骤3)中的熔解曲线根据所述收集到的荧光信号通过PCR熔解曲线分析程序得到。