[发明专利]采用大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法

说明书

本发明涉及采用大肠埃希氏菌JL‑HYP发酵生产羟脯氨酸的方法，包括以下步骤，大肠埃希氏菌JL‑HYP菌株经斜面活化，再经梯度稀释，涂布于LB培养基上，培养后，挑取单个菌落分别接种到LB斜面培养基上，置于生化培养箱30‑36℃培养12h；从LB斜面培养基上挑取单个菌落接种到装有种子培养基的种子瓶中培养；将种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行培养30‑45h，得到含有羟脯氨酸的发酵液；提取含有羟脯氨酸的发酵液中的羟脯氨酸；本发明该工艺发酵周期短，菌体密度高，羟脯氨酸的产量和得率高。本发明发酵周期短，菌体密度高，羟脯氨酸的产量和得率高。

技术领域

本发明涉及一种生产羟脯氨酸的方法，具体的说是采用大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法。

背景技术

羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，全名为，顺式-4-羟基-L-脯氨酸;是L-脯氨酸羟基化后的产物，其分子式为C₅H₉NO₃。羟脯氨酸呈白色片状结晶或结晶性粉末，微甜，熔点为274℃，易溶于水，微溶于乙醇。

目前，国内外报道的生产羟脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法四种，其中蛋白水解提取法是目前普遍采用的工业生产方法。但是，蛋白水解提取法需经过强酸强碱处理，纯化步骤长，而且羟脯氨酸提取率在4％-7％，提取和原料成本高，不仅浪费大量原料，而且废弃物污染严重，随着目前环境压力的增加和资源原料价格的上升，传统的蛋白水解提取法正逐渐被市场淘汰。微生物发酵法正以其绿色环保的工艺、原料和成本低廉的优势迅速发展起来。

微生物发酵法生产羟脯氨酸的研究还处于实验室阶段，尚未形成成熟的工业化生产工艺，而先进的工业化生产工艺，尤其是菌种的固体培养配方及方法对于羟脯氨酸的发酵单位、成本和三废排放有重要影响。福建师范大学黄建忠等人利用大肠杆菌HYP035(Escherichia#coli.HYP035)生产羟脯氨酸,其发酵液中羟脯氨酸产量为45g/L，脯氨酸的转化率达到85％,发酵周期为40h。江南大学张震宇等人利用重组大肠杆菌发酵生产羟脯氨酸,通过利用脯氨酸-4-羟化酶基因和色氨酸启动子序列,先优化设计色氨酸串联启动子和脯氨酸-4-羟化酶结构基因,然后全基因合成色氨酸串联启动子基因和脯氨酸-4-羟化酶结构基因后,将启动子和结构基因连接到pAMP质粒上,构建了可过量表达脯氨酸-4-羟化酶的重组质粒pAMP-P2trp-Hyp,将该重组质粒导入大肠杆菌，构建出重组大肠杆菌；摇瓶发酵结果表明,该重组大肠杆菌的羟脯氨酸的产量达到0.31g/L。

另外，现有技术中自发酵液中分离提取羟脯氨酸，通常采用离子交换方法，将除去菌体的发酵液在特定的pH条件下上柱，让羟脯氨酸吸附在离子交换柱上，随后用去离子水对离子交换柱充分洗涤，除去杂质，然后用洗脱液将羟脯氨酸从离子交换柱上洗脱，得到羟脯氨酸溶液，再经过结晶和干燥，得到羟脯氨酸产品。该方法存在以下缺陷：①羟脯氨酸易氧化，收率不稳定；②粗羟脯氨酸杂质多、色泽深，影响精制收率及产品质量。③耗水量大，酸碱用量大，在生产过程中会产生大量的废渣和废水对环境造成非常严重的污染。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供采用大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法，该工艺发酵周期短，菌体密度高，羟脯氨酸的产量和得率高。

采用大肠埃希氏菌JL-HYP发酵生产羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：

步骤一、大肠埃希氏菌JL-HYP菌株经斜面活化，生化培养箱37℃培养20h，再经梯度稀释，涂布于LB培养基上，培养后，挑取单个菌落分别接种到LB斜面培养基上，置于生化培养箱30-36℃培养12h；从LB斜面培养基上挑取单个菌落接种到装有种子培养基的种子瓶中培养，培养条件：温度30-36℃、摇床转速200rmp、培养时间6-8 h；当OD值长到1.0-2.0时，得到种子液，备用；