[发明专利]一种抗癌类海洋中药中硒形态的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于化学成分检测技术领域，具体是指一种抗癌类海洋中药中硒形态的检测方法。

背景技术

硒是人体和动物不可缺少的微量元素之一，具有多种生物学功能。研究表明硒与抗肿瘤活性有关，具有“抗癌之王”之称，如甲基-硒代半胱氨酸对乳腺癌、肝癌细胞有抑制作用。硒缺乏则会引发慢性克山病；硒过量会导致硒中毒，引起脱发、偏瘫等症状；适量硒有抗癌等功能。人体内硒适宜浓度范围很窄，食品营养委员会建议我国一般居民膳食硒供给量为40μg/d-400μg/d。硒的生理功能不仅与其含量有关，更与其形态密切相关。无机硒有毒且不易被人体吸收，而有机硒有较高的生物利用度和生物活性。

被誉为“蓝色药业”的海洋中药已成为抗癌新药研究开发的重要领域，多种海洋天然产物已进入临床研究，备受研究者关注。海洋生物富含硒元素，且硒主要以有机硒形式存在，如硒代蛋氨酸等。硒元素在抗肿瘤医学有着举足轻重的作用，但关于其中的活性有机物质的医学研究报道较多，其中硒形态分析报道较少。

目前，硒总量测定技术已经成熟，但是，硒的形态分析仍是分析化学的研究前沿领域。最常用的检测硒形态的技术为HPLC-HG-AFS(高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱联用技术)和HPLC-ICP-MS(高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术)，但ICP-MS仪器价格昂贵，运行成本高，不宜推广。形态分析中关键在于前处理，从而保持样品形态和最初的一致性。传统的硒形态的提取方法有水提、酸提取、碱提取等。水产品中硒形态的检测方法(中国专利申请号201310376921.3)采用70℃去离子水震摇1h浸提来提取样品中硒的形态，由于硒有的以蛋白结合态为主，水提取不易将样品中的硒化合物释放出来。从高硒酵母中提取含硒蛋白的方法(中国专利申请号：201110440135.6)则对富硒酵母进行碱法提取其中的硒蛋白，但该方法所用的强碱溶液易破坏其中的硒形态，不能将其中的硒形态进行“原”分析。近年来，酶提取以其高效、温和的独特优势正逐步代替传统的化学试剂提取。常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、脂肪酶、纤维素酶、蛋白酶XIV等。一种高硒真菌中硒形态测定的方法(中国专利申请号：201510656845.0)通过对样品进行弱碱破壁处理与球磨后，利用处理过的样品，采用分步连续提取的方式，37℃恒温培养酶解18～24h后，将酶解液过膜后利用HPLC-HG-AFS进行硒形态的测定；一种粮食样品中硒形态的测定方法(中国专利申请号：201510113923.2)则将样品加入提取缓冲液超声提取20min后，依次加入纤维素酶蛋白酶K和蛋白酶XIV恒温振荡培养17h。这些提取方法一般酶解耗时较长，受环境因素影响较大，不宜将其推广。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种操作简便，硒形态可保持与最初的一致性且成本相对较低的抗癌类海洋中药硒形态的检测方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案是包括以下步骤：

(1)样品的前处理

1.1)将抗癌类海洋中药的样品置于超低温冰箱冷冻过夜，取出置于冷冻干燥机中-90℃低温干燥48h，用中药粉碎机粉碎，过100目筛，混合均匀，得到样品粉末，备用；

1.2)准确称取1.0000g样品粉末于50mL离心管中，加入5～30mg蛋白酶XIV(链酶菌的蛋白酶)和10.0mL超纯水，旋涡混匀，加盖密封，37℃下超声2～14min；

1.3)将样品提取液以4000r/min离心20min，取上清液过0.45μm的水系微孔滤膜，得到样品待测提取液；

(2)上机测定，将所得的样品待测提取液通过高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱联用方法测定样品中的硒形态，该联用方法所用的标准溶液为：

含硒代胱氨酸(GBW-10087)、甲基-硒代半胱氨酸(GBW-10088)、亚硒酸根(GBW-10032)、硒代蛋氨酸(GBW-10034)的储备标准溶液，用0.1mol/L的盐酸逐级稀释成0ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL的标准使用液，4℃保存；

(3)结果计算：根据所测得的色谱图对硒的4种形态进行定性和定量的计算，在优化好的色谱条件下，四种硒形态的出峰顺序依次为硒代胱氨酸，甲基-硒代半胱氨酸，亚硒酸盐，硒代蛋氨酸；以色谱峰的保留时间来定性；用峰面积外标法来定量各硒形态，公式如下：

X＝C×V×F/m

式中：X—样品中待测物质的含量，μg/kg；

C—待测液中该物质的含量，μg/L；