[发明专利]多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法。

背景技术

侵袭性真菌含有主要的致病真菌有念珠菌属、曲霉属、隐球菌属等条件致病真菌，还有组织胞浆菌、皮炎芽生菌、孢子丝菌等地方流行性致病真菌。不同环境下，含有的真菌种类不同。侵袭性真菌含有早期没有特异性表现，所以很容易被掩盖，病死率很高。

新型隐球菌(Cryptococcus Neoformans，CN)是一种可引起人类严重含有的酵母样病原真菌，主要引起细胞免疫功能低下者，如器官移植、肺癌患者及艾滋病(AIDS)患者并发隐球菌病。

曲霉菌包括132个种和18个变种，临床上常见的有烟曲霉(A.fumigatus)，黄曲霉(A.flavus)，黑曲霉(A.niger)，杂色曲霉(A.versicolor)和构巢曲霉(A.nidulans)等。

其中烟曲霉存在于谷物、污染的食品、土壤和霉腐物中，是引起人和动物曲霉病的重要病原菌。含有肺部和其他器官，也能引起敏症。烟曲霉可寄生于肺内，发生肺结核样症状，是肺曲霉病的主要病原菌，还可产生烟曲霉毒素。黑曲霉能引起曲霉菌病，还能产生黑曲霉毒素。黄曲霉可引起肺、外耳道、皮肤脓皮病样曲霉病等，有些菌系可产生黄曲霉毒素，引起中毒或致癌。

目前市面上关于曲霉菌的实时荧光定量检测试剂盒寥寥无几，关于新生隐球菌和曲霉菌双重检测的试剂盒几乎没有。临床上，特别是肺癌患者免疫力低下的情况，经常伴随着新生隐球菌和曲霉菌双重真菌含有。所以研发多重荧光定量PCR同时检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒及方法显便具有重要意义。

发明内容

本发明一个目的是提供检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量试剂。

本发明提供的试剂，包括检测新生隐球菌的引物1、检测新生隐球菌的引物2、检测新生隐球菌的探针1、检测曲霉菌的引物3、检测曲霉菌的引物4和检测曲霉菌的探针2；

所述引物1的核苷酸序列为序列2；

所述引物2的核苷酸序列为序列3；

所述探针1的核苷酸序列为序列4；

所述引物3的核苷酸序列为序列6；

所述引物4的核苷酸序列为序列7；

所述探针2的核苷酸序列为序列8。

上述试剂还包括内标荧光探针3，所述内标荧光探针3的核苷酸序列为序列10。

上述试剂中，所述各个探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。

上述试剂中，所述引物1、所述引物2、所述探针1、所述引物3、所述引物4、所述探针2和所述探针3的摩尔比为2:2:1:2:2:1:1。

本发明的另一个目的是提供检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，包括上述试剂；

所述各引物在所述PCR试剂中的浓度为0.4uM；

所述各探针在所述PCR试剂中的浓度为0.2uM。

含有上述试剂或所述PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

试剂盒中还可以包括新生隐球菌IGS-1基因序列的标准品、曲霉菌ITS-1基因序列的标准品、内标、阳性对照品和阴性对照品。

新生隐球菌IGS-1基因序列的标准品为将序列1所示的新生隐球菌IGS-1基因特异序列与pGEM-T载体连接，得到新生隐球菌质粒，即为标准品。

曲霉菌IGS-1基因序列的标准品为将序列5所示的新生隐球菌IGS-1基因特异序列与pGEM-T载体连接，得到曲霉菌质粒，即为标准品。

内标：为将序列9所示的内标序列与pGEM-T载体(Promega，产品编号A362A)连接，得到内标质粒，即为标准品。

阳性对照品为灭活的新生隐球菌、烟曲霉菌、黑曲霉菌和黄曲霉的DNA提取物的混合物(按3：1：1：1质量比混合)。

阴性对照品为正常人的痰液提取液。

上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在检测或定量检测新生隐球菌和/或曲霉菌中的应用也是本发明保护的范围；

或上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在制备检测或定量检测新生隐球菌和/或曲霉菌产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在制备检测待测样本是否含有新生隐球菌和/或曲霉菌产品中的应用也是本发明保护的范围。