[发明专利]用于构建布鲁氏菌突变株的质粒pZF17-30及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种用于构建布鲁氏菌突变株的质粒pZF17‑30及其构建方法和应用，构建过程主要包括从商业化质粒pCMV‑BE3中扩增rAPOBEC1‑nCas9‑UGI片段，并将该片段与含有泛宿主复制子pBBR1‑MCS‑5和非特异性sgRNA的载体通过重组反应整合到一起，随后将ccdB基因与Chl抗性基因插入sgRNA中；利用限制性内切酶BsaI酶切质粒pZF17‑30，将特异性sgRNA与线性化pZF17‑30连接，构建的载体的序列如SEQ ID NO.3所示，该载体可用于构建布鲁氏菌突变株，将virB10基因CDS区478位碱基由C突变为T。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于构建布鲁氏菌突变株的质粒pZF17-30及其构建方法，可用于布鲁氏菌基因编码区终止突变，蛋白质翻译提前终止。

背景技术

布鲁氏菌病(brucellosis)是一种波及世界的重要的人畜共患病，对畜牧业造成了严重的经济损失，因为它人畜共患病的特点，也使其成为了人类健康和社会安全的一大威胁。然而，迄今为止，都未能研发出安全有效的疫苗。布鲁氏菌(Brucella)，又称作布氏杆菌，是造成布鲁氏菌病的病原体，要研发出安全有效的疫苗，对该菌各类基因的功能研究是十分重要的。

目前，对布鲁氏菌基因的功能研究存在许多困难。一是布鲁氏菌生长缓慢，在实验室稳定的培养环境下，菌体需要生长36-48h才能在平板上长出肉眼可见的菌落，初次分离的野生菌株生长往往更加缓慢。二是布鲁氏菌病人畜共患的特征，使得对布鲁氏菌的操作变的相当繁琐和耗时。这些因素都使得对布鲁氏菌基因的研究变得格外困难。随着对布鲁氏菌致病机理的深入研究以及与其相关的分子生物学技术的发展，布鲁氏菌病基因工程疫苗的研究成为生命科学的一项重要课题，基因工程疫苗有望代替传统的弱毒活疫苗，成为安全有效新型布病疫苗。基因工程疫苗旨在解决传统布病疫苗存在的安全、保护力低、干扰血清学诊断等问题，主要包括基因工程弱毒活疫苗、活载体疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗。其中基因工程活疫苗是利用分子生物学技术将布鲁氏菌的某个毒力基因进行缺失或者过提高保护性抗原的表达，由于其具有安全性更高、可以利用血清学诊断区分疫苗接种和自然感染，是目前布鲁氏菌病疫苗的研究热点(景志刚等2016)。利用分子生物学技术在強毒株或分离株上将毒力基因进行缺失，研发基因缺失疫苗。例如LPS合成基因如pgm、wboA、per等基因缺失突变株；外膜蛋白基因如omP25、omP31、bp26等基因缺失突变株；代谢通路和转录调控因子必须基因如vrrB2、vjbR等基因缺失突变株。这些基因缺失突变株改善了传统布鲁氏菌病弱毒疫苗安全性差、干扰血清学免疫诊断等缺点。但是目前构建布鲁氏菌毒力基因缺失的技术大多使用传统的同源重组结合自杀质粒进行，但是传统的同源重组技术存在自身的弊端，例如，针对不同的靶基因需要重新构建复杂的打靶和筛选载体质粒使得操作繁琐、工作量大、耗时长、增加了实验成本，同时载体质粒的构建也受克隆载体及靶基因所在的基因组上的限制性酶切位点的限制，进行功能基因组学实验操作时，克隆载体可能无法承受大片段的DNA，此外传统的同源重组技术发生重组的概率低(Copeland et al 2001)，限制了该项技术在实验室大规模应用，也使得布鲁氏菌毒力基因研究进展缓慢，因此这种传统的布鲁氏菌基因编辑技术有望得到改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种质粒pZF17-30，包含氯霉素抗性基因和毒性基因ccdB，两个酶切位点Bsa I，方便质粒重组筛选，可在大肠杆菌和布鲁氏菌等细菌中复制。

本发明的再一个目的在于提供由pZF17-30构建得到的载体在制备布鲁氏菌的单碱基突变株中的应用，仅需要插入特异性sgRNA，转化布鲁氏菌后即可实现对特定基因终止突变，获得细菌突变株。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

质粒pZF17-30的构建方法，其步骤是：