[发明专利]一种基于原子力显微镜体外分析启动子与RNA聚合酶间交互作用的方法

权利要求书

1.一种用于原子力显微镜分析的将RNA聚合酶固定于硅基质表面的方法，其特征是：首先将抛光的单晶硅片进行羟基化处理，硅烷化，再经戊二醛交联，通过RNA聚合酶上的氨基与醛基的缩合反应，将RNA聚合酶固定在硅基质表面。

2.一种用于原子力显微镜分析的将启动子固定于AFM探针表面的方法，其特征是：合成具有巯基末端、重复碱基的柔性末端的单链启动子序列，通过解链-退火形成双链，在AFM金镀层探针上以HS-Au共价反应的形式获得固定有启动子的AFM探针。

3.一种基于原子力显微镜力谱技术的启动子与RNA聚合酶交互作用分析的方法，其特征是：采用原子力显微镜控制修饰有启动子的AFM探针，与固定有RNA聚合酶的基底表面接近/远离，记录这一过程中探针与基底表面的力-距离信息，绘制力-距离曲线，得到两者之间的交互作用信息。

4.如权利要求1所述的方法，其特征为，所述单晶硅片硅羟基化处理的具体方法是，选择抛光的适当大小的单晶硅片作为基底，在食人鱼溶液中洗涤硅片表面30min，将羟基化的硅片用超纯水和乙醇漂洗3次。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述单晶硅片硅烷化方式处理的具体方法是：在室温下将羟基化处理后的单晶硅片浸于3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐溶液中3h，用超纯水和乙醇漂洗3次。

6.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述戊二醛交联、RNA聚合酶上的氨基与醛基的缩合反应的具体方法是，权利要求5处理后的单晶硅片在室温下浸于戊二醛溶液中活化30min，反应结束后迅速用超纯水漂洗3次，将活化的基底表面浸润在500-10000U/ml RNA聚合酶磷酸盐溶液中，在4℃或室温放置30分钟-2小时，最后用PBS缓冲溶液冲洗3次，去除没有固定的蛋白质。

7.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述的具有巯基末端、重复碱基的柔性末端的单链启动子序列是，在合成的单链启动子序列的正义链3'端添加TTTTT柔性连接序列，然后再链接SHC6巯基末端，与此相对应的反义链在5’末端添加AAAAA柔性连接序列。

8.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述单链启动子退火形成双链的具体方法是，将等摩尔两条互补单链启动子DNA链混合，95℃保温5min，自然缓慢冷却8h以上至室温。

9.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述固定有启动子的AFM探针的操作方法是，在有金镀层的AFM探针用乙醇、超纯水交替浸泡洗涤各10min以清洁金尖端的表面，然后将探针转移到含有3'-巯基修饰的5μmol/L双链启动子中12h，以自组装单分子层的形式，通过巯基与金形成的共价键获得启动子修饰的AFM探针末端。

10.如权利要求3所述的方法，其特征是，所述修饰有启动子的AFM探针的具体制备方法是，将10μmol/L的两条互补DNA链等摩尔比混合于PBS缓冲液中，95℃保温5min，自然缓慢冷却8h以上至室温；有金镀层的AFM探针用乙醇、超纯水交替浸10min以清洁金尖端的表面；然后将探针转移到含有3'-巯基修饰的5μmol/L双链启动子中12h，以自组装单分子层的形式获得启动子修饰的AFM探针末端。

11.如权利要求3所述的方法，其特征是，首先在液体环境下，干净的硅基质表面进行探针弹性系数矫正；有RNA聚合酶固定的硅基底表面通过原子力显微镜扫描，确定RNA聚合酶的位置信息；在有RNA聚合酶的位置正上方、距离表面500-1000nm，控制AFM探针做靠近硅基质，在硅基质表面施加一定的力并停留5-10秒，最后远离硅基质；采集这一过程中的力、距离信息，绘制力-距离曲线。