[发明专利]一种基于原子力显微镜体外分析启动子与RNA聚合酶间交互作用的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于原子力显微镜得到启动子与RNA聚合酶力-距离曲线的方法。

背景技术

近年来，随着代谢工程及合成生物学的发展，以启动子为代表的代谢调控元件的标准化、模块化处理已成为趋势，因此高效、精确、定量表征启动子活性的方法是一个重要的先决条件。

目前启动子强度主要通过报告基因编码的蛋白表达量来表征，如氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicol acetyl transferase，CAT)，β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。然而这种分析方法操作繁琐、周期长、易受到菌体生长阶段和生理状态的干扰，最终的表达量还受到其他多重元件的调控，并不能直接体现启动子的调控效果，并且造成不同表达系统之间的启动子强度数据无法直接比较。加之受到检测方法的限制，导致定量分析效率低，半定量表征，制约了启动子元件化，标准化的发展。

AFM技术作为一个原位、不需标记的微观表面成像技术已被广泛熟知。此外，AFM另一个强大的功能为分子操作，而基于AFM的力谱(Force spectroscopy)分析技术可以实现精确、实时的记录发生在毫秒的一对分子的结合和解离过程，提供两者之间的结合力以及单分子作用力的群体分布。由于力谱分析技术可以提供精确的定量结合力数据；能在体外、液体环境中，接近生理条件下操作；不受细胞生长及生理状态的影响；不涉及其他细胞分子的干扰，是一种研究生物分子交互作用的强有力的手段。

现有技术中没有通过采用原子力显微镜直接测量启动子与RNA聚合酶之间的交互作用的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种原子力显微镜用于检测启动子与RNA聚合酶单分子间交互作用的方法，通过对硅基底的一系列化学修饰分别固定RNA聚合酶和启动子在硅基质表面和AFM探针表面，并采用原子力显微镜控制启动子与RNA聚合酶的接触、结合和解离，从而检测启动子与RNA聚合酶单分子间的相互作用，进而提供一种体外研究转录系统的新方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种原子力显微镜用于检测启动子与RNA聚合酶单分子间交互作用的方法。首先将抛光的单晶硅片进行羟基化处理，然后以不同的硅烷化方式处理硅基底，再经戊二醛和RNA聚合酶修饰；合成含有巯基和柔性连接的启动子单链，通过退火形成双链启动子，在AFM金镀层探针上以自组装单分子层的形式获得启动子修饰的AFM探针末端；采用原子力显微镜控制启动子与RNA聚合酶的接触、结合和解离，记录这一过程的力-距离曲线，从而分析启动子与RNA聚合酶反应的过程。

包括以下步骤：

(1)基底硅表面羟基化：选择抛光的单晶硅片(1×1cm2)作为基底，在食人鱼溶液中洗涤硅片表面30分钟。将羟基化的硅片用超纯水和乙醇漂洗3次。

(2)硅烷化方式处理硅基底：在室温下将羟基化的硅片浸于3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐溶液中3h。用超纯水和乙醇漂洗3次。

(3)所述基底羟基化硅表面上RNA聚合酶的固定：充分清洗后的羟基化硅表面在室温下浸于戊二醛溶液中活化30min，反应结束后用超纯水漂洗3次。将活化的基底表面浸润在1-1000U/mlRNA聚合酶磷酸盐溶液中，最适的浓度为100U/ml，4℃放置40min，最后用PBS缓冲溶液冲洗3次，去除没有固定的蛋白质。

(4)巯基修饰的启动子：实验所用的启动子序列均由杰瑞生物公司合成，体外相互作用所用的启动子序列3'端添加TTTTT柔性连接序列，然后再链接SHC6巯基末端。

(5)AFM金镀层探针修饰启动子：将10μmol/L的两条互补DNA链等摩尔比混合于PBS缓冲液中，95℃保温5min，自然缓慢冷却(>8h)至室温。有金镀层的AFM探针用乙醇、超纯水交替浸泡洗涤各10min以清洁金尖端的表面。然后将探针转移到含有3'-巯基修饰的双链启动子(5μmol/L)中12h，以自组装单分子层的形式获得启动子修饰的AFM探针末端。

(6)原子力显微镜成像及相互作用力测定：RNA聚合酶基底表面的图像的扫描在智能模式下进行。对实验中用到的每一个针尖进行了弹性系数的校正，测定的探针的弹性常数在0.34-0.6N/m之间。控制力曲线测定时的AFM探针approaching/retracting速度在514-900nm/s之间，使不同探针在测定力曲线时的loading rate保持一致，为304nN/s。从而检测出启动子与RNA聚合酶间的交互作用力。