[发明专利]一种新的树突状细胞疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法。

背景技术

肿瘤已经继心血管疾病成为威胁人类健康的第二大杀手。常规的肿瘤治疗手段包括手术治疗、放疗和化疗等。但现有的肿瘤治疗方法不能很好的解决肿瘤复发和迁移的问题。肿瘤免疫治疗作为新兴的第四种肿瘤治疗方法，鉴于其较好的疗效和安全性，在肿瘤治疗和预防方面展示出具有巨大的应用潜力与前景。

肿瘤免疫治疗可分为主动免疫治疗和被动免疫治疗两类。树突状细胞疫苗属于主动免疫治疗。它可以携带肿瘤抗原信息，激活特异性T细胞产生应答反应，产生抗肿瘤效应。树突状细胞(DC，Dendritic Cell)是人体内功能最强的抗原递呈细胞(APC，Antigen presentation cell)，具有强大的T细胞激活能力，并能活化幼稚T细胞(T cell)、刺激B淋巴细胞增殖成熟、诱导机体产生特异性Th细胞、CD8+胞毒T细胞(CTL)，引发机体产生特异性应答。因此，树突状细胞肿瘤疫苗可以作为一种治疗肿瘤的有效手段。目前，DC细胞疫苗已经在世界范围内用于多种肿瘤治疗的临床研究，但治疗的临床效果小于初始预期。

树突状细胞免疫疗法临床疗效有限的原因是肿瘤细胞的低免疫原性和肿瘤免疫抑制微环境。由于人体内DC细胞数量很少，因此如何提高DC细胞疫苗的细胞活力、增加其抗原呈递和T细胞激活能力成为临床治疗的核心问题。

现有的DC细胞制备步骤包括DC细胞的诱导和DC成熟两步。其中DC细胞的成熟程度决定了DC抗原递呈的效果。在临床试验中，DC成熟方案有五种之多，其中包括经典的四种细胞因子组合(TNF-α、IL-Iβ、IL-6、PGE-2)、a-DC细胞因子组合(TNF-α、IL-1β、IFN-α、IFN-g、Poly I：C))以及LPS等。本发明人发现，四因子组合的成熟方案所得的DC成熟度最好。该方案中使用的PGE2可以促进DC表达CCR7，促进DC细胞的归巢。但PGE2的存在显著降低了DC细胞分泌IL-12的水平。IL-12参与幼稚T细胞分化为Th1细胞，它被称为T细胞刺激因子，其可以刺激T细胞的生长和功能。同时IL-12可以介导自然杀伤细胞(NK cell)和特异性CD8+CTL的细胞毒活性的增强，促进这些细胞的杀伤功能。

因此，如何增强DC分泌IL-12的能力，延长DC细胞在体内的存活时间，从而有效诱导Th1、胞毒T淋巴细胞增殖和肿瘤特异性杀伤作用具有重要作用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种树突状细胞疫苗的制备方法。通过电穿孔的方法向DC细胞中导入外源Bcl-2和IL-12mRNA。这些细胞不仅呈现成熟DC的表型，细胞存活时间也显著延长、IL-12的表达量显著提高，而且其体外诱导肿瘤特异性胞毒T细胞的能力也明显加强。

为实现上述目的，设计人树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，包括如下步骤：

a.体外合成人源Bcl-2、IL-12p70mRNA；

b.分离和培养DC；

c.采用电穿孔的方法将Bcl-2和IL-12p70mRNA导入DC细胞中。

在所述a.步骤中，包括以下步骤：

a1.将人Bcl-2基因和IL-12p70基因分别构建到载体上；

a2.将含有Bcl-2和IL-12p70基因的质粒载体用speI进行线性化；

a3.以线性化质粒为模板，体外转录合成、纯化Bcl-2和IL-12p70mRNA。

在所述b.步骤中，包括以下步骤：

b1.分离外周血中的单个核细胞，细胞短时贴壁培养之后，移除悬浮细胞；

b2.加入诱导剂GM-CSF和IL-4，诱导单核细胞向DC细胞分化；

b3.诱导培养5-7天后，向细胞培养基中加入DC诱导成熟因子，成熟方案可选择四种因子组合(TNF-α、IL-Iβ、IL-6、PGE-2)或者两种因子组合(TNF-α、PGE-2)。

b4.诱导成熟20-24小时后，收集成熟DC细胞；

在所述c.步骤中，包括以下步骤：

c1.通过电穿孔的方法将体外合成的Bcl-2以及IL-12p70mRNA导入到DC细胞内。

c2.继续培养1-2天，检测细胞成熟度、细胞存活率、细胞上清IL-12p70分泌量。

作为优选，步骤a3中，线性化质粒的浓度为0.5-2ug/ul；

作为优选，步骤a3中，体外转录为mRNA后，用DNA酶处理mRNA15-30分钟，去除DNA模板；