[发明专利]一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用

权利要求书

1.一种突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生；所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点，该位点突变为K或Q，所述A型DNA聚合酶序列如SEQ ID NO:1-8任意一项所示。

2.根据权利要求1所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点，507位氨基酸位点突变为K，742位氨基酸位点突变为K。

3.突变型A型DNA聚合酶在用dUTP取代dTTP的核酸扩增、制备用dUTP取代dTTP的核酸扩增试剂盒、制备表达载体和/或制备宿主细胞中的应用；

所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生；所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点，该位点突变为R、V、K或Q，或所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点，507位氨基酸位点突变为K，742位氨基酸位点突变为K，所述A型DNA聚合酶序列如SEQ ID NO:1-8任意一项所示。

4.编码权利要求1-2任意一项所述突变型A型DNA聚合酶的核酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求4所述核酸序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，转化有权利要求5所述表达载体。

7.权利要求1-2任意一项所述突变型A型DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，培养权利要求6所述的宿主细胞进行蛋白表达，收集并破碎宿主细胞，纯化蛋白，获得所述突变型A型DNA聚合酶。

8.一种核酸扩增的方法，其特征在于，在包含dUTP的核酸扩增体系中，采用突变型A型DNA聚合酶进行扩增，获得目标核苷酸序列；所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生；所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点，该位点突变为R、V、K或Q，或所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点，507位氨基酸位点突变为K，742位氨基酸位点突变为K；所述A型DNA聚合酶序列如SEQ ID NO:1-8任意一项所示。

9.一种用于产生延伸的多核苷酸的试剂盒，其特征在于，包含突变型A型DNA聚合酶、核苷酸、至少包含dUTP的三磷酸核苷、适合于寡核苷酸延伸的缓冲液；所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生；所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点，该位点突变为R、V、K或Q，或所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点，507位氨基酸位点突变为K，742位氨基酸位点突变为K；所述A型DNA聚合酶序列如SEQ ID NO:1-8任意一项所示。

10.一种反应混合物，其包含突变型A族DNA聚合酶、至少一种寡核苷酸、多核苷酸模板和至少含dUTP的三磷酸核苷；所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生；所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点，该位点突变为R、V、K或Q，或所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点，507位氨基酸位点突变为K，742位氨基酸位点突变为K；所述A型DNA聚合酶序列如SEQ IDNO:1-8任意一项所示。