[发明专利]一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用，所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生。本发明提供了一种与未经改造突变的A型DNA聚合酶相比具有增强的dUTP掺入速度的突变型A型DNA聚合酶，其掺入dUTP的效果明显好于对照A型DNA聚合酶，因此更加适用于一些用dUTP取代dTTP的核酸扩增体系中，使该体系在防止核酸扩增产物污染的同时又不损失目的产物的扩增效率，从而满足食品、动物检疫、人类疾病筛查等多重PCR领域、法医领域及科研应用需求。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用。

背景技术

DNA聚合酶是以核苷酸链为模板在有镁离子的情况下通过形成新的‘3-5’磷酸二酯键将dNTP掺入到新合成的核苷酸链中，从而复制DNA。在体内，DNA聚合酶参与包括DNA的复制，DNA的修复等复杂的反应。在体外，通过PCR(聚合酶链式反应)技术，DNA聚合酶可以大量合成DNA。

DNA聚合酶作为DNA生命的最基本的酶促反应，随着生命的进化而进化。所有的DNA聚合酶家族都有一个共同的双二价离子催化中心，但在其他结构上则有较大的差别。不考虑这些DNA聚合酶构象上的明显差异，所有的聚合酶结构在组成上都可以看做是一个“右手”的结构。这个结构包括“Thumb”“palm”“fingers”三个结构域。其中，palm结构域最为保守，这里有聚合酶的催化中心区域。

除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性部位也被证明是相对易变的，能够容纳某些氨基酸置换而不显著降低DNA聚合酶活性。这些突变型DNA聚合酶可以改善DNA聚合酶的某些性能，例如提高保真性、抗盐能力等，从而满足工业和研究应用中的不同需求。

在扩增实验室，最常见的污染物是核酸扩增产物的污染，造成核酸扩增产物污染的形式最可能是气溶胶污染，核酸扩增反应体系在开盖、摇动、吸样过程中与空气接触形成气溶胶，造成严重的核酸扩增产物污染现象。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳使实验结果判断为假阳性。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题[Avoiding false positives with PCR-Nature 1989Jun 8；339(6224):490.]。

为了防止核酸扩增产物的污染，避免PCR结果的假阳性，专利US5035996提出了dUTP取代dTTP的核酸扩增体系，这样的核酸扩增体系扩增后的核酸扩增产物都是含有dU的DNA链。在下次PCR扩增开始前，体系中加入尿嘧啶糖基化酶(简称UNG酶)，其可降解核酸链中的尿嘧啶碱基，但不降解反应体系中游离的dUTP，并增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。随后UNG酶被灭活，不会再降解新扩增的产物U-DNA。这一体系被广泛地应用于诊断试剂中，并起到了较好的效果。

目前这个体系存在的问题是，当用dUTP取代dTTP时，野生型Taq DNA聚合酶对dUTP的掺入速率要比dTTP低很多，导致目的产物的扩增效率较低，因此需要把dUTP加入量提高2到3倍来提高Taq DNA聚合酶对目的产物的扩增效率(例如：dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝1：1：1：2和dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝1：1：1：3)。当游离镁离子浓度低的时候，野生型Taq DNA聚合酶的这个问题尤其严重。因此，在用dUTP代替dTTP进行核酸扩增的体系中，野生型Taq DNA聚合酶结构上的缺陷，使其在此应用领域受到限制。

发明内容