[发明专利]一种检测转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器及其检测方法

说明书

本发明公开了一种检测转录因子NF‑κBp50的荧光化学传感器及其检测方法，该传感器以2‑氨基嘌呤(2‑AP)为荧光基，采用目标驱动的自发的等温扩增、核酸外切酶辅助荧光信放大策略，且没有任何额外的引物和模板的参与的情况下实现对转录因子的超灵敏检测，操作简便、快速，试验结果准确、可靠。经试验验证，本发明技术方案检测极限达到4.04×10^‑4毫克每毫升，可与实时荧光定量PCR法相媲美。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种检测转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器及其检测方法。

背景技术

DNA结合蛋白在基因组复制，基因转录，细胞分裂和DNA修复过程中起着至关重要的作用。而大部分的DNA结合蛋白都扮演着转录因子的角色，调节着细胞的发育，分化和增殖，由此转录因子也已经成为临床诊断和药物筛选中的靶点。因此，开展对DNA结合蛋白的超灵敏检测不仅对基础生物化学的深入研究有很大帮助，同时对发展人类疾病的新的治疗方法和策略具有重大意义。

迄今为止，在DNA结合蛋白检测方法中，传统的电泳迁移法(EMSA)和DNA酶足迹法检测灵敏度偏低，而且同位素标记探针会引起放射性污染。而酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印迹法(Western Blotting)需要与蛋白结合的特异性抗体，操作步骤繁琐。基于荧光能量共振转移(FRET)的方法需要有双荧光标记的DNA探针，大大增加了实验的成本。为了提高检测的灵敏度，各种转录因子检测方法中引入了核酸扩增策略，如实时聚合酶链反应(PCR)，指数扩增反应(EXPAR)，解旋酶依赖性扩增(HDA)、滚环扩增(RCA)，和近红外荧光固相滚环扩增(NIRF sRCA)法。在这些方法中，实时荧光定量PCR技术由于它的高灵敏度和实用性得到了越来越多的关注，但它需要的温度循环的精确控制与参与的荧光标记探针(TaqMan probe)和DNA结合的特异性抗体。虽然指数扩增EXPAR可能几分钟内提供高扩增效率，它涉及到复杂的反应原理。基于指数扩增(EXPAR)的比色分析法需要用DNA修饰纳米金粒子，指数扩增诱导的化学发光分析法需要DNA的转录，双指数扩增反应和G-四链体脱氧核酶驱动化学发光反应一系列复杂步骤。近红外荧光固相滚环扩增(NIRF sRCA)包含蛋白结合DNA探针的细致划分并且需要捕获探针和滚动圆模板的复杂制备。因此，亟需开发一种新的方法用于快速、灵敏、简便、廉价地检测转录因子。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种检测转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器，该传感器以2-氨基嘌呤(2-AP)为荧光基，采用目标驱动的自发的等温扩增、核酸外切酶辅助荧光信放大策略，且没有任何额外的引物和模板的参与的情况下实现对转录因子的超灵敏检测，操作简便、快速，试验结果准确、可靠。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种检测细胞内转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括：转录因子NF-κBp50结合探针和辅助探针；

其中，转录因子NF-κBp50结合探针由一个p50-s探针与p50-anti反探针杂化组成，p50-s探针与p50-anti反探针序列上有两个不相邻的转录因子识别位点，所述p50-s探针转录因子识别位点序列为5'-GGG ACT TTC C-3'，两个转录因子识别位点之间存在磷酸二酯键为硫代修饰；所述p50-s探针与p50-anti反探针上均设计有2-氨基嘌呤(2-AP)荧光基；所述p50-s探针与p50-anti反探针5'端的磷酸二酯键均为硫代修饰；

所述辅助探针为与p50-s探针、p50-anti反探针近5'端的部分碱基序列互补，从而在检测过程中减少背景荧光信号；

所述荧光化学传感器还包括核酸外切酶III，Nb.BtsI内切酶，λ核酸外切酶和KF聚合酶；