[发明专利]一种自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法

权利要求书

1.一种自体三联皮肤成纤维细胞制剂，其特征在于，所述自体三联皮肤成纤维细胞制剂由富血小板血浆、自体胶原浓缩液和自成纤维细胞组成；

血小板血浆、自体胶原浓缩液体积比为1:4混匀作为基础液，加入自体成纤维细胞，终浓度是1.0×10⁷/ml～2.0×10⁷/ml。

2.一种如权利要求1所述自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一，人皮肤成纤维细胞分离、培养；

步骤二，自体高浓度胶原蛋白液的制备；

步骤三，自体血小板富集血浆的制备；

步骤四，三联成纤维细胞注射制剂制备。

3.如权利要求2所述的自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：

(1)标本处理：皮肤标本放于无钙镁磷酸缓冲液DPBS瓶中，4℃保存，带回GMP级实验室；将取回的标本置于生物安全柜，标本移入平皿内，首先用1×磷酸盐缓冲液DPBS 5ml浸润15min，用1ml移液枪吸弃，再用1×DPBS同样反复冲洗，然后用500u/ml氨苄青霉素和500mg/ml硫酸链霉素的1×DPBS溶液中浸泡消毒10min后，用1×DPBS液用力反复冲洗5次，直至标本发白，轻度发胀，在平皿中修剪皮下筋膜，剔除脂肪，将标本剪碎，后面相同；

(2)分离：用1mg/ml的混合胶原酶MNP-S在37℃条件下消化1h，分离表皮与真皮；去除表皮，真皮组织剪成约0.1mm³～0.3mm³大小，加入Tryple select无动物源性消化液，37℃条件下继续消化15min；当成纤维细胞大部分从组织中分离出来时，加入10％FBS高糖-IMDM培养基终止消化，移入离心管，1000r/min离心5min，收集沉淀；

(3)培养和传代，将获得的细胞及剩余的组织块一并接种于75cm²培养瓶中，加入1ml完全培养基，注意切勿使培养物浮起，置37℃5％CO₂培养箱中培养；于培养24h后补充培养液，此后隔3天半定量换液；原代细胞融合至70％时，Tryple select无动物源性消化液消化，200目过滤去除组织块，按照1：2比例转入T175传代，培养基改为加含10％自体血清培养基；从P2代开始，以1:5的比例传代，培养至第四代，可获得2×10⁸～3×10⁸成纤维细胞。

4.如权利要求2所述的自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：自体真皮成纤维细胞在体外培养扩增过程中，分泌胶原蛋白、纤连蛋白，在换液时，将所有含分泌蛋白上清全部收集，放于离心管，采用冷冻浓缩技术浓缩，获得高浓度胶原蛋白大于1500ug/ml，放于4℃冰箱无菌保存。

5.如权利要求2所述的自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：

(1)将临床无菌采集的自体静脉血200ml从采血袋或注射器中移入到离心管中，全血离心450g，10min；

(2)全血分层为无明显界限的两层，取上层液体，取到红细胞层以上的包括白细胞在内的上层部分血浆；

(3)将获得的血浆3000g离心15min，温度22℃±2℃，使血小板下沉；

(4)吸出上层少血小板血浆，放于另一无菌离心管中，作为制备培养成纤维细胞培养基的血清，余下5ml～10ml血浆混匀，即为浓缩血小板。

6.如权利要求2所述的自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述四具体包括：将获得自体三联、自体胶原浓缩液按照1:4的比例混匀，作为制剂的基础液，加入成纤维细胞，使制剂的成纤维细胞浓度为1.0×10⁷/ml-2.0×10⁷/ml，PRP中血小板浓度为0.5×10⁹/ml～0.6×10⁹/ml；胶原蛋白浓度为大于1500ug/ml，三位一体，制备成了无菌的三联成纤维细胞注射液制剂。

7.一种由权利要求1～6任意一项所述自体三联成纤维细胞注射液制剂制备方法制备的皮肤除皱、抗衰美容制剂。