[发明专利]一种自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于抗衰老美容产品技术领域，尤其涉及一种自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法。

背景技术

日前，市场上已经有各种美容方面的产品，肉毒杆菌内毒素作为目前主流的美容产品，因其使用简便、效果显著、安全可靠而广受欢迎。但它们使用后的副反应较多，常见的有表情不自然、畏光流泪、局部肿胀、淤斑、注射部位麻木、头痛、额部紧绷感、邻近部位皱纹加深等。这两种因子应用易产生较明显的依赖性，随着注射的次数增多，人对其敏感性降低，导致病人使用该方法更为频繁，每次的使用量也会逐渐增多。在皮肤老化的过程中，成纤维细胞(Fibroblasts，Fbs)会出现一系列生物学特性改变，真皮组织中成纤维细胞及其所分泌的胶原蛋白的减少，不仅胶原纤维的总量下降，不同类型胶原纤维的比例也发生变化，是皮肤老化并呈现各种皱纹的主要原因。这些变化最终都使真皮变薄、退化而衰老。本发明针对皮肤衰老、疤痕形成的主要原因，制备全部由自体的成分——自体皮肤成纤维细胞、自体PRP及自体胶原蛋白构成的制剂，作为自身移植材料，具有良好的组织相容性，在皮肤的年轻化和治疗性塑型中发挥重要作用。自体Fbs移植术后形态自然、疗效持久、无排斥反应，在维持皮肤年轻化，抗衰老方面具有较好的效果。具有安全、有效、维持时间长的特点。当然，目前市场上应用的成纤维细胞是单纯的自体成纤维细胞注射填充液，有的添加一些外源生长因子，这有可能发生过敏反应。自体PRP中含有大量多种自体生长因子，这些生长因子可促进包括移植的Fbs在内的存活、增殖，填充修复损伤皮肤或祛除皱纹。

发明内容

本发明的目的在于提供一种自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，旨在解决成纤维细胞安全、有效、维持时间长的个体化定制制剂的问题。

本发明是这样实现的，一种自体三联皮肤成纤维细胞制剂，所述自体三联皮肤成纤维细胞制剂由字体PRP、自体胶原浓缩液和成纤维细胞组成；

PRP与胶原浓缩液体积比为1:4混匀作为基础液，加入自体成纤维细胞，终浓度是1.0×10⁷/ml～2.0×10⁷/ml。

本发明的另一目的在于提供一种所述自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法，所述自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一，人皮肤成纤维细胞分离、培养；

步骤二，自体高浓度胶原蛋白液的制备；

步骤三，自体血小板富集血浆的制备；

步骤四，三联成纤维细胞注射制剂制备。

进一步，所述步骤一具体包括：

(1)标本处理：皮肤标本放于无钙镁磷酸缓冲液(DPBS)瓶中，4℃保存，带回GMP级实验室；将取回的标本置于生物安全柜，标本移入平皿内，首先用1×DPBS 5ml浸润15min，用1ml移液枪吸弃，再用1×DPBS同样反复冲洗，然后用500u/ml氨苄青霉素和500mg/ml硫酸链霉素的1×DPBS溶液中浸泡消毒10min后，用1×DPBS液用力反复冲洗5次，直至标本发白，轻度发胀，在平皿中修剪皮下筋膜，剔除脂肪，将标本剪粹，后面相同；

(2)分离：用1mg/ml的混合胶原酶MNP-S在37℃条件下消化1h，分离表皮与真皮；去除表皮，真皮组织剪成约0.1mm³～0.3mm³大小，加入Tryple select无动物源性消化液，37℃条件下继续消化15min；当成纤维细胞大部分从组织中分离出来时，加入10％FBS高糖-DMEM培养基终止消化，移入离心管，1000r/min离心5min，收集沉淀；

(3)培养和传代，将获得的细胞及剩余的组织块一并接种于75cm²培养瓶中，加入1ml完全培养基，注意切勿使培养物浮起，置37℃5％CO₂培养箱中培养；于培养24h后补充培养液，此后隔3d半定量换液；原代细胞融合至70％时，Tryple select无动物源性消化液消化，200目过滤去除组织块，按照1：2比例转入T175传代；从P2代开始加含10％自体血清培养基，以1:5的比例传代，培养至第四代，获得2×10⁸～3×10⁸成纤维细胞。

进一步，所述步骤二具体包括：自体真皮成纤维细胞在体外培养扩增过程中，分泌胶原蛋白、纤连蛋白。在换液时，将所有含分泌蛋白上清全部收集，放于离心管，采用冷冻浓缩技术浓缩，获得高浓度胶原蛋白>1500ug/ml，放于4℃冰箱无菌保存。

进一步，所述步骤三具体包括：