[发明专利]一种少突胶质前体细胞的培养方法

权利要求书

1.一种少突胶质前体细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.脐带血单个核细胞经MSCs培养基培养得到P1代脐带血MSCs；

S2.P1代脐带血MSCs经神经球培养基培养收获P3代神经球细胞；

S3.P3代神经球细胞经OPCs培养基培养得到OPCs，所述OPCs培养基为包含以下物质的神经培养基：

0.5mM L-谷氨酰胺；

2％B-27^TM添加剂；

1uM 1，25-二羟维生素D3；

20ng/mL重组人血小板来源生长因子AA；

4ng/mL重组人神经营养因子3，

所述步骤S3中，培养OPCs所使用的培养器皿为重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的组织培养瓶。

2.根据权利要求1所述的一种少突胶质前体细胞的培养方法，其特征在于，所述神经球培养基为包含以下物质的神经培养基：

0.5mM L-谷氨酰胺；

2％B-27^TM添加剂；

20ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子；

20ng/mL重组人表皮生长因子。

3.根据权利要求1所述的一种少突胶质前体细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括如下步骤：脐带血单个核细胞经洗涤重悬，铺至淋巴细胞分离液上，离心后取中间云雾层；以MSCs培养基重悬细胞，隔天换液，至70-80％汇合时收获；收获时先加入胰蛋白酶溶液消化，再加入抑肽酶溶液终止消化；离心弃上清，收获沉淀物；沉淀物以细胞筛过滤，收集滤液；滤液离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代脐带血MSCs；P0代脐带血MSCs以MSCs培养基重悬培养至70-80％汇合时收获P1代脐带血MSCs。

4.根据权利要求1所述的一种少突胶质前体细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，培养神经球细胞所使用的培养器皿为细菌培养皿。

5.根据权利要求4所述的一种少突胶质前体细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2进一步包括如下步骤：以神经球培养基重悬P1代脐带血MSCs，接种至细菌培养皿中，37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养；隔天添加新的神经球培养基，连续培养7天，传代培养2～3次。

6.根据权利要求5所述的一种少突胶质前体细胞的培养方法，其特征在于，所述传代培养具体包括如下步骤：传代时，轻轻吹打培养液，离心，以神经球培养基重悬沉淀，轻轻吹打，使得神经球成3-5个细胞的细胞团或单个细胞，按1∶5分盘传代培养。

7.根据权利要求1所述的一种少突胶质前体细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以神经球培养基悬浮P3代神经球细胞，接种细胞悬液至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的组织培养瓶中，培养第24小时，加入OPCs培养基，培养第72小时，全部换OPCs培养基，继续培养4天，传代培养至P2代。

8.根据权利要求7所述的一种少突胶质前体细胞的培养方法，其特征在于，所述传代培养具体包括如下步骤：传代时，先加入Accutase^TM消化液室温消化，再加入抑肽酶溶液终止消化，离心弃上清，以OPCs培养基重悬沉淀，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的组织培养瓶中，培养4天后收获P1代OPCs，继续传代至P2代。