[发明专利]检测金黄色葡萄球菌及肠毒素B试剂盒的制备方法及应用有效
申请号: | 201710728640.8 | 申请日: | 2017-08-23 |
公开(公告)号: | CN107525930B | 公开(公告)日: | 2019-02-15 |
发明(设计)人: | 黄昊文;谭芳;谢潇雪;许爱清;邓克勤 | 申请(专利权)人: | 湖南科技大学 |
主分类号: | G01N33/569 | 分类号: | G01N33/569;G01N21/78 |
代理公司: | 湘潭市汇智专利事务所(普通合伙) 43108 | 代理人: | 宋向红 |
地址: | 411201 *** | 国省代码: | 湖南;43 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 金黄色葡萄球菌 肠毒素B 金颗粒 鸡蛋壳膜 显色 试剂盒 吸附 制备 双氧水 金黄色葡萄球菌DNA 应用 柠檬酸三钠 定性检测 含量检测 金纳米簇 聚乙二醇 显色效果 合成金 金硫键 氯金酸 纳米簇 适配体 吸光度 种检测 抗原 粮食作物 水中 巯基 修饰 分解 检测 | ||
1.一种检测金黄色葡萄球菌试剂盒的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将金黄色葡萄球菌及参考细菌革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌分别与鸡蛋壳膜孵育半小时,其中,枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌作为对照;
(2)依据金黄色葡萄球菌与金黄色葡萄球菌DNA适配体ATCC-aptamer的特异性结合,再加入修饰了具有过氧化物模拟酶活性的金纳米簇的ATCC-aptamer;
(3)金颗粒显色步骤:向体系中加入柠檬酸三钠溶液、聚乙二醇溶液、双氧水溶液和氯金酸溶液,根据金黄色葡萄球菌浓度的不同,使其与ATCC-aptamer连接的量也会不同,金颗粒呈现的颜色也不一样,如此达到定性检测金黄色葡萄球菌的目的。
2.根据权利要求1所述检测金黄色葡萄球菌试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤(2)所述ATCC-aptamer碱基序列为:
5’-HS-TCCCTACGGCGCTAACCTCCCAACCGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTACAAC-3’。
3.根据权利要求1所述检测金黄色葡萄球菌试剂盒的制备方法,其特征在于:在步骤(2)所述加入修饰了具有过氧化物模拟酶活性的金纳米簇的ATCC-aptamer之后,加入1mg/mL的BSA封闭鸡蛋壳膜表面的孔隙。
4.根据权利要求1所述检测金黄色葡萄球菌试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤(2)所述的修饰了具有过氧化物模拟酶活性的金纳米簇的ATCC-aptamer,是将体积比为5:3的ATCC-aptamer与金纳米簇,反应10小时后,采用截留量为3500的透析袋透析24小时所得。
5.根据权利要求1所述检测金黄色葡萄球菌试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤(3)所述金颗粒显色步骤中,加入的柠檬酸三钠溶液、聚乙二醇溶液、双氧水溶液以及氯金酸溶液中,柠檬酸三钠溶液浓度为4mmol/L,聚乙二醇溶液为纯聚乙二醇溶液稀释50倍所得,双氧水溶液浓度为500μmol/L,氯金酸溶液浓度为1 mmol/L,四种溶液的体积比为1:1:1:1。
6.一种检测肠毒素B试剂盒的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将鸡蛋壳膜与氯金酸在碱性环境中反应24小时,依据鸡蛋壳膜上主要蛋白还原氯金酸而得到具有强烈红色荧光的鸡蛋壳膜金纳米簇;
(2)再将合成有金纳米簇的鸡蛋壳膜与谷胱甘肽溶液反应4小时,得到具有过氧化物模拟酶活性的鸡蛋壳膜金纳米簇;
(3)将上一步得到的鸡蛋壳膜金纳米簇通过金硫键与带巯基的肠毒素B DNA适配体SEB-aptamer相连接;
(4)依据SEB-aptamer与肠毒素B的特异性结合,加入不同浓度的肠毒素B,反应20分钟;
(5)金颗粒显色步骤:向体系中加入柠檬酸三钠溶液、聚乙二醇溶液、双氧水溶液和氯金酸溶液,根据肠毒素B浓度的不同,覆盖鸡蛋壳膜金纳米簇的面积不一样,金颗粒呈现的颜色也不一样,再根据金颗粒在波长550nm处的吸光度值与肠毒素B浓度的关系,能计算得到待测样品中肠毒素B的含量。
7.根据权利要求6所述检测肠毒素B试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤(3)所述SEB-aptamer碱基序列为: 5’-HS-GGTATTGAGGGTCGCATCCACTGGTCGTTGTTGTCTGTTGTCTGTTATGTTGTTTCGTGATGGCTCTAACTCTCCTCT-3’。
8.根据权利要求6所述检测肠毒素B试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤(5)所述金颗粒显色步骤中,加入的柠檬酸三钠溶液、聚乙二醇溶液、双氧水溶液以及氯金酸溶液中,柠檬酸三钠溶液浓度为4mmol/L,聚乙二醇溶液为纯聚乙二醇溶液稀释50倍所得,双氧水溶液浓度为500μmol/L,氯金酸溶液浓度为1 mmol/L,四种溶液的体积比为1:1:1:1。
9.根据权利要求6所述检测肠毒素B试剂盒的制备方法,其特征在于:对肠毒素B的检测限值为0.04ng/mL。
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