[发明专利]检测金黄色葡萄球菌及肠毒素B试剂盒的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种检测金黄色葡萄球菌及肠毒素B试剂盒的制备方法及应用。将金黄色葡萄球菌吸附至鸡蛋壳膜表面，再加入修饰了金纳米簇的金黄色葡萄球菌DNA适配体，进行金颗粒显色，鸡蛋壳膜吸附金黄色葡萄球菌浓度不同，金颗粒显色不同，实现对金黄色葡萄球菌定性检测。先在鸡蛋壳膜上合成金纳米簇，通过金硫键接入带巯基的DNA适配体，再加入不同浓度的肠毒素B反应后，进行金颗粒显色，肠毒素B浓度不同，双氧水被分解的量不同，使得最后与柠檬酸三钠、聚乙二醇、氯金酸反应后显色效果不同。依据金颗粒吸光度值与抗原浓度的关系，计算未知样品中肠毒素B含量。本发明应用于食品、粮食作物、水中金黄色葡萄球菌或中肠毒素B的含量检测。

技术领域

本发明属于化学生物传感以及生物检测技术领域，具体涉及一种基于鸡蛋壳膜检测金黄色葡萄球菌及肠毒素B试剂盒的制备方法及应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种可导致人畜共患病的重要致病菌，该菌在自然界广泛存在于空气、水、尘埃及人和动物的排泄物中。金黄色葡萄球菌能产生多种致病性物质，如毒素、酶类和菌体的一些成分。

金黄色葡萄球菌能产生多种致病性物质，这些物质一旦过量进入人体，会使人中毒。食物中毒是一个全球性公共卫生问题，无论是过去还是现在，在发达的工业化国家和发展中国家，食物中毒都常有发生。据美国疾病预防控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希菌，居第二位，占细菌性食物中毒的33％，加拿大的发生率更高，占细菌性食物中毒的45％，我国每年发生的此类中毒事件也非常多，全国各地均有报告，是疾病预防控制部门重点监测的疾病。大量的事实表明，食品安全问题严重影响人们的日常生活，急需建立一种针对金黄色葡萄球菌的超高灵敏度快速分析方法。肠毒素是一组具有超抗原活性的细菌毒素，人体摄入过量的肠毒素，也会引发病症，损坏人体器官，对人体健康有极大的危害，因而建立一种针对肠毒素的分析检测方法亦极其重要。

鸡蛋壳膜(ESM)中含有丰富的蛋白质，少量的脂质体和糖类，因其独特的结构性质可在其表面合成金纳米簇。研究表明鸡蛋壳膜金纳米簇具有一定的催化能力，在鸡蛋壳膜金纳米簇存在下，H₂O₂被快速催化分解。由氯金酸通过H₂O₂还原法可以方便地制备出各种不同粒径的纳米金颗粒，其颜色依直径大小而呈红色至蓝色。同时，金纳米颗粒随直径的变化呈现出不同的颜色，其紫外-可见吸收峰也会相应发生变化。在金纳米颗粒的制备中，双氧水溶液是重要的反应物之一，而鸡蛋壳膜金纳米簇能催化分解双氧水，之后双氧水的浓度发生改变，金纳米颗粒就会呈现出不同的颜色，从红色、紫红色至蓝色。基于此，我们可建立一种双模检测的新方法，既可利用颜色变化对待测物进行可视化半定量检测，又可以通过吸光度的大小对待测物的准确含量进行定量检测。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种检测金黄色葡萄球菌试剂盒的制备方法，它包括如下步骤：

(1)将金黄色葡萄球菌及参考细菌革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌分别与鸡蛋壳膜孵育半小时，其中，枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌作为对照；

(2)依据金黄色葡萄球菌与金黄色葡萄球菌DNA适配体(ATCC-aptamer)的特异性结合，再加入修饰了具有过氧化物模拟酶活性的金纳米簇的ATCC-aptamer；

(3)金颗粒显色步骤：向体系中加入柠檬酸三钠溶液、聚乙二醇溶液、双氧水溶液和氯金酸溶液，根据金黄色葡萄球菌浓度的不同，使其与ATCC-aptamer连接的量也会不同，金颗粒呈现的颜色也不一样，如此达到定性检测金黄色葡萄球菌的目的。

具体的，步骤(2)所述ATCC-aptamer碱基序列为：

5’-HS-TCCCTACGGCGCTAACCTCCCAACCGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTACAAC-3’。