[发明专利]一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法在审
| 申请号： | 201710732641.X | 申请日： | 2017-08-23 |
| 公开（公告）号： | CN107474127A | 公开（公告）日： | 2017-12-15 |
| 发明（设计）人： | 霍林巨;罗玉娇;张常昕;夏艳冬;司品法;张允雷;刘一佑;金伟;雷兰婷 | 申请（专利权）人： | 湖南甲骨文生物医药有限公司 |
| 主分类号： | C07K14/435 | 分类号： | C07K14/435;C07K1/18;C07K1/20;C07K1/14;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 410000 湖南省长沙市高新开发*** | 国省代码： | 湖南;43 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 毒素 蛋白 高效 表达 分离 纯化 方法 | ||
1.一种敬钊毒素蛋白的高效表达方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；
(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；
(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；
(4)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养。
2.根据权利要求1所述的一种敬钊毒素蛋白的高效表达方法，其特征在于所述步骤(1)的引物序列为：
上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA
下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。
3.一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；
(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；
(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；
(4)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养；
(5)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白分离与纯化：收集酵母表达系统培养液，采用阳离子交换柱层析的分步洗脱方法进行蛋白分离，采用反相高效液相色谱进行纯化。
4.根据权利要求3所述的一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)所述的引物序列为：
上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA
下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。
5.根据权利要求3所述的一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，其特征在于步骤(5)所述的阳离子交换柱层析的分步洗脱方法过程为：将表达上清液注射入系统中，在上样完毕接着用0.1M NaAc、pH 4.2的平衡液冲柱子，使波长280nm处检测值达到基线，光吸收值不再跳动，之后依次用含有0.1M、0.2M和0.3M NaCl的0.1M NaAc、pH 4.2的缓冲液进行洗脱，收集各洗脱峰。
6.根据权利要求3所述的一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，其特征在于步骤(5)所述的采用反相高效液相色谱进行纯化过程为：检测波长为280nm，反相柱温度为40℃，先用体积分数0.1％TFA的双蒸水脱盐10min，将所收集各洗脱峰的溶液上Waters的C18反相柱进行脱盐，按照制定的洗脱梯度进行洗脱，收集洗脱峰时标记好各峰的出峰时间。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于湖南甲骨文生物医药有限公司，未经湖南甲骨文生物医药有限公司许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201710732641.X/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
