[发明专利]一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及敬钊缨毛蛛粗毒中活性多肽JZTX-58的高表达系统构建与分离纯化方法。

背景技术

疟疾是原生动物寄生虫疟原虫(paslmodium)引起的传染性寄生虫疾病，这种疾病几乎流行于所有的热带和亚热带国家。现在，每年有500百万人感染此病，遍及非洲、南亚次大陆、东南亚和南美洲；每年有250万人死于此病，其中约有1百万人是5岁以下的儿童。可悲的是，目前疟原虫对治疗疟疾所用的药物普遍产生了抗药性(耐药性)。抗疟原虫活性的新型药物研究成为防治疟疾的新热点。

蜘蛛利用毒液麻痹和杀死猎物，并防御其它肉食性动物。研究发现，蜘蛛毒液中含有各种各样的生物活性分子，随着生物科学技术的发展与突破，部分多肽毒素分子己被开发成为生物学、医学、药物学等众多研究领域的先导分子。

敬钊缨毛蛛(Chilobrachys jingzhao)是一类地下穴居的原始蜘蛛,隶属狒蛛科、棒刺蛛亚科、缨毛蛛属，是近年在我国发现的又一蜘蛛新种，产于广西及海南等地。其形态与海南捕鸟蛛、虎纹捕鸟蛛十分相似，个体较海南捕鸟蛛大，体呈黄褐色，腹部背面无虎纹斑。毒性及凶猛程度更大，其毒液对小鼠具有致命性(IC50为0.4mg/kg)。敬钊缨毛蛛粗毒中含有多种生物活性成分。采用阳离子交换与反相高效液相色谱技术，己从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化得到敬钊毒素-58(JZTX-58)。对JZTX-58的氨基酸序列进行BLAST分析,发现Psalmopeotoxin I和II与JZTX-58有很高的同源性，而Psalmopeotoxin I和II具有抗疟原虫活性，因此推测JZTX-58具有抗疟原虫活性，这对研究抑制疟原虫传播和有效治疗疟疾具有深远的意义。

敬钊缨毛蛛粗毒中含有的多肽毒素种类很多，而其中含量较丰富的毒素分子只有极少数几种，对于大部分含量不够丰富的毒素分子(如JZTX-58)若用直接从粗毒中分离纯化的手段则很难得到足量的毒素来进行功能研究。因此，通过基因工程技术，构建高效表达系统，来表达敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白，为进一步研究JZTX-58的抗疟原虫活性奠定了重要的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法。为实现本发明的目的，采用如下技术方案：

一种敬钊毒素蛋白的高效表达方法，包含以下步骤：

(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；

(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；

(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；

(4)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养。

优选的，所述步骤(1)的引物序列为：

上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA，

下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。

一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，包含以下步骤：

(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；

(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；

(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；

(4)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养；

(5)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白分离与纯化：收集酵母表达系统培养液，采用阳离子交换柱层析的分步洗脱方法进行蛋白分离，采用反相高效液相色谱进行纯化。

优选的，步骤(1)所述的引物序列为：

上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA，

下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。