[发明专利]重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法及所得株和应用

权利要求书

1.一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株，通过自杀质粒pRE112介导的同源重组法，构建同时缺失asd、crp和rfbN三个基因的菌株；

(2)通过Gibson组装的方法将纽波特沙门菌ATCC 27869的O-抗原基因簇部分基因片段wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ与含T1T2终止子、pSC101origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段进行融合连接，构建Asd⁺质粒pCZ11-1；所述wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(3)将步骤(2)所得Asd⁺质粒pCZ11-1转入步骤(1)所得菌株，即得所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株；

所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌具有100％的免疫保护效率；所述纽波特沙门菌对于BALB/C小鼠的LD50为2×10⁷CFU。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，设计6对引物分别缺失鼠伤寒沙门菌ATCC14028菌株的rfbN、asd和crp三个基因，突变顺序为asd、crp、rfbN；进行利用自杀质粒pRE112介导的同源重组操作时，利用所述6对引物分别对asd、crp和rfbN基因的上、下游同源臂进行扩增和融合，得到融合片段，再对融合片段和质粒pRE112进行酶切和连接处理；

所述6对引物的序列如下：

DrfbN 1F CGGGGTACCGTATGTGGTCGTACTGAC

DrfbN 1R TTTGACGAAGTTATTTTGATTCCGCCAACC

DrfbN 2F ATCAAAATAACTTCGTCAAAAGAGATAAAATA

AATG

DrfbN 2R TCCCCCCGGGGCATGTCTGACAGCTTTC

Dasd 1F CGGGGTACCCGGCGCGATTGTCGGGATG

Dasd 1RCGCCCCATAAAGCGTTTTTTTCCTGCAAAG

Dasd 2F GGAAAAAAACGCTTTATGGGGCGCCGC

Dasd 2RTCCCCCCGGGGTCCGGCTTGGGTCTGGTGC

Dcrp-1F CGGGGTACCCGCAGTTGGTGACATTCTGACG

Dcrp-1R TCTGACGGAAGCGCGGTTATCCTCTG

Dcrp-2F ATAACCGCGCTTCCGTCAGAATGGCGC

Dcrp-2R TCCCCCCGGGGCCATAGCCAGAACCAAAACCA。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，扩增所述上、下游同源臂时，反应体系为：模板DNA1μl，2×primeSTARMax25μl，上游引物1μl，下游引物 1μl，ddH₂O 22μl；扩增条件为：94℃变性2min后进入循环，循环参数为94℃10sec，55℃15sec，72℃10sec；30个循环后，72℃延伸8min。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，进行所述融合处理时，将上下游同源臂按照摩尔数1:1的比例混合，取其中2μl作为模板，然后利用相应引物和高保真酶primeSTARMax进行PCR扩增，得到融合片段。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，进行所述酶切和连接处理时，方法为：分别用KpnI和XmaI酶酶切融合片段和pRE112质粒，将融合片段和质粒酶切出互补粘性末端，并回收质粒和片段；利用T4DNA连接酶将酶切后的融合片段与pRE112质粒连接，16℃，过夜，转化λpir大肠杆菌感受态细胞SM10中，待其长出后进行PCR鉴定，获得阳性重组自杀质粒。