[发明专利]重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法及所得株和应用

说明书

本发明提供了一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法，其包括步骤：以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株，通过自杀质粒pRE112介导的同源重组法，构建缺失asd、crp和rfbN基因的菌株；通过Gibson组装的方法将纽波特沙门菌ATCC 27869的O‑抗原基因簇部分基因片段wzx‑wbaR‑wbaL‑wbaQ‑wzy‑wbaW‑wbaZ与含T1T2终止子、pSC101 origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段进行融合连接，构建Asd+质粒pCZ11‑1；将所得Asd+质粒pCZ11‑1转入上述所得菌株，即得。本发明构建得到的重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌SLN06具有100％的免疫保护效率。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法及所得株和应用。

背景技术

非伤寒沙门菌(Not-typhoidal Salmonella)能够引起人类、哺乳类、鸟类、爬行类等多种动物的食物源性人畜共患病，对公共卫生安全造成了重要威胁。据统计，全世界每年超过9000万人感染NTS而引发肠胃炎，并造成至少15万人的死亡。此外，NTS还能引起全球范围内的免疫缺陷病人或非洲地区人群的系统性感染，引发菌血症、败血症及脑膜炎等，死亡率较高。接触受污染的动物产品，如鸡蛋、肉制品等是人感染沙门菌的重要途径，因而控制沙门菌在动物与人类间的传播是沙门菌病防控的关键。

NTS血清型多达上千种，然而据研究，在人类和动物中流行的血清型主要是鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)、肠炎沙门菌和血清群C沙门菌(如纽波特沙门菌、猪霍乱沙门菌、婴儿沙门菌等)。疫苗是控制疾病最经济有效的手段，随着沙门菌耐药现象日益严重，人们意识到一种能够预防多种血清型的沙门菌多价疫苗是防控动物和人类非伤寒沙门菌病的迫切需求。然而，目前尚无应用于人类的非伤寒沙门菌疫苗，开发的商品化动物用疫苗均为单价疫苗，交叉免疫保护力不足。

因此，本领域亟需可解决上述问题的技术出现。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株的构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)以鼠伤寒沙门菌ATCC14028为基础菌株，通过自杀质粒pRE112介导的同源重组法，构建同时缺失asd、crp和rfbN三个基因的菌株；

(2)通过Gibson组装的方法将纽波特沙门菌ATCC 27869的O-抗原基因簇部分基因片段wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ与含T1T2终止子、pSC101 origin、asd基因表达盒、Amp抗性基因盒和Ptrc启动子的DNA骨架片段进行融合连接，构建Asd⁺质粒pCZ11-1；所述wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(3)将步骤(2)所得Asd⁺质粒pCZ11-1转入步骤(1)所得菌株，即得所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株；

所述重组鼠伤寒沙门菌二价疫苗株具有高水平的针对同源LPS和异源LPS的血清IgG应答，对同源强毒株—鼠伤寒沙门菌ATCC14028和异源强毒株—纽波特沙门菌具有100％的免疫保护效率；所述纽波特沙门菌对于BALB/C小鼠的LD₅₀为2x10⁷CFU。

步骤(1)中，设计6对引物分别缺失鼠伤寒沙门菌ATCC14028菌株的rfbN、asd和crp三个基因，突变顺序为asd、crp、rfbN；进行利用自杀质粒pRE112介导的同源重组操作时，利用所述6对引物分别对asd、crp和rfbN基因的上、下游同源臂进行扩增和融合，得到融合片段，再对融合片段和质粒pRE112进行酶切和连接处理；