[发明专利]一种三重RT-PCR特异性扩增引物组及三重鉴定的RT-PCR检测方法有效
| 申请号： | 201710749394.4 | 申请日： | 2017-08-28 |
| 公开（公告）号： | CN107326103B | 公开（公告）日： | 2021-06-15 |
| 发明（设计）人： | 郭晶;李旭勇;刘文强;李玉保 | 申请（专利权）人： | 聊城大学 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京律谱知识产权代理事务所(普通合伙) 11457 | 代理人： | 黄云铎 |
| 地址： | 252000 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 三重 rt pcr 特异性 扩增 引物 鉴定 检测 方法 | ||
1.一种三重RT-PCR特异性扩增引物组，其特征在于，所述三重RT-PCR特异性扩增引物组用于快速鉴定H6亚型及N1和N2两种不同NA亚型AIV，所述三重RT-PCR特异性扩增引物组包括三组引物对，所述三组引物对为：第一引物对A、第二引物对B和第三引物对C，所述第一引物对A为A1-UP和A1-LOW，所述第二引物对B为B1-UP和B1-LOW，所述第三引物对C为：C1-UP和C1-LOW，其中，所述A1-UP和A1-LOW分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述B1-UP和B1-LOW分别如序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述C1-UP和C1-LOW分别如序列表SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
2.一种非诊断目的的快速鉴定H6亚型及N1和N2两种不同NA亚型AIV的三重RT-PCR检测方法，包括下述步骤：
(1)获取目标样品；
(2)从目标样品中提取病毒RNA；
(3)以所提取的病毒RNA为模板，加入通用引物反转录出cDNA；
(4)以所获得的cDNA为模板加入权利要求1所述的三重RT-PCR特异性扩增引物组进行PCR扩增；扩增后利用琼脂糖凝胶电泳法分析，基于PCR产物中DNA序列的长度确定是否存在H6N1和H6N2亚型AIV。
3.根据权利要求2所述的三重RT-PCR检测方法，其特征在于：所述的三重RT-PCR特异性扩增引物组在用于PCR的试剂中的用量分别为浓度20pM的A1-UP和浓度20pM的A1-LOW各0.5μL、浓度20pM的B1-UP和浓度20pM的B1-LOW各0.5μL、浓度20pM的C1-UP和浓度20pM的C1-LOW各0.5μL。
4.根据权利要求3所述的三重RT-PCR检测方法，其特征在于：RT-PCR扩增的反应体系为20μL：5×buffer 4μL，2.5mM dNTP 1μL，rTaq酶0.5μL，cDNA 1μL，浓度20pM的A1-UP和浓度20pM的A1-LOW各0.5μL、浓度20pM的B1-UP和浓度20pM的B1-LOW各0.5μL、浓度20pM的C1-UP和浓度20pM的C1-LOW各0.5μL，用去离子水补至20μL。
5.根据权利要求3所述的三重RT-PCR检测方法，其特征在于：RT-PCR扩增的反应程序为：
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