[发明专利]一种三重RT-PCR特异性扩增引物组及三重鉴定的RT-PCR检测方法有效

专利信息
申请号: 201710749394.4 申请日: 2017-08-28
公开(公告)号: CN107326103B 公开(公告)日: 2021-06-15
发明(设计)人: 郭晶;李旭勇;刘文强;李玉保 申请(专利权)人: 聊城大学
主分类号: C12Q1/70 分类号: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
代理公司: 北京律谱知识产权代理事务所(普通合伙) 11457 代理人: 黄云铎
地址: 252000 山*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 一种 三重 rt pcr 特异性 扩增 引物 鉴定 检测 方法
【说明书】:

发明提供了一种三重RT‑PCR特异性扩增引物组及三重鉴定的RT‑PCR检测方法。本发明的三重RT‑PCR特异性扩增引物组用于快速鉴定H6亚型及两种不同NA亚型AIV,所述三重RT‑PCR特异性扩增引物组包括三组引物对,所述三组引物对为:第一引物对A、第二引物对B和第三引物对C,所述第一引物对A包括A1‑UP和A1‑LOW,所述第二引物对B包括B1‑UP和B1‑LOW,所述第三引物对C包括:C1‑UP和C1‑LOW。本发明的三重RT‑PCR特异性扩增引物组可以同时鉴别H6亚型和两种不同NA亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,简称AIV)。发明人对三重RT‑PCR检测方法进行优化,使灵敏度提高到100EID50/100μl,检测时间缩短至1.5小时,而且特异性强,一个实验即可确定H6N1或H6N2亚型AIV感染。

技术领域

本发明属于动物病毒病诊断技术领域,具体涉及一种三重RT-PCR特异性扩增引物组以及利用该引物组同时快速鉴定H6亚型及两种不同NA亚型 AIV的三重RT-PCR检测方法。

背景技术

H6亚型AIV同样在世界范围内流行较为广泛。H6亚型AIV最初在 1965年分离自美国的火鸡,随后相继在野鸟、水禽和陆禽中分离到。欧洲和美国的流行病学监测显示,H6亚型AIV是监测中分离率较高的亚型之一,同时相对于其他亚型的AIV有更广的宿主范围。虽然H6亚型AIV感染水禽后仅引起亚临床症状,但是鸡感染该亚型病毒后会伴随产蛋下降、上呼吸道感染以及增加鸡群的发病率和死亡率。多个研究显示,某些H6亚型 AIV可以感染小鼠和雪貂,并引起发病。有报道2013年我国台湾省出现一例人感染H6N1的病例;Wang等人报道,近年我国南方地区分离的H6亚型AIV已经具备在豚鼠上的水平传播能力,这些研究报道均显示该亚型对公共卫生安全的威胁日益增大。

2013年5月,中国台湾报道了一例人感染H6N1亚型AIV的病例,这也是全球范围内首次出现人感染H6亚型AIV的事件,引起各界的高度重视。因此,对H6亚型AIV的及时、快速、准确诊断方法的建立非常必要。目前,针对H6亚型AIV的检测方法较少,应用较多的鉴定方法是病毒的分离测序、血凝抑制试验、神经氨酸酶试验等常规方法,这些实验虽然准确率高,但是耗时长、费用高,无法满足疫病暴发时对疫病快速、及时诊断的要求;而且这些检测方法存在共同的问题是只能确定该病毒是否是H6亚型AIV,不能确定是H6N1还是H6N2亚型AIV。

因此,流行病学调查和疫病现场诊断上迫切需要一种能够快速、准确的鉴别H6N1和H6N2亚型AIV的检测方法。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种同时鉴定H6亚型及两种不同NA亚型AIV的RT-PCR检测引物组及相应检测方法。本发明的引物组和检测方法可以一次检测中确定H6N1或H6N2亚型AIV。不但能够确定病毒是否是H6亚型AIV,还能够确定是N1或N2亚型AIV,而且对当前流行毒株具有很好的针对性。

具体而言,本发明采用以下技术方案来解决:

一种三重RT-PCR特异性扩增引物组,其特征在于,所述三重RT-PCR 特异性扩增引物组用于快速鉴定H6亚型及两种不同NA亚型AIV,所述三重RT-PCR特异性扩增引物组包括三组引物对。

在一种优选实现方式中,所述三组引物对为:第一引物对A、第二引物对B和第三引物对C,所述第一引物对A包括A1-UP和A1-LOW,所述第二引物对B包括B1-UP和B1-LOW,所述第三引物对C包括:C1-UP和 C1-LOW。

另一方面,本发明提供一种快速鉴定H6亚型及两种不同NA亚型AIV 的三重RT-PCR检测方法,包括下述步骤:

(1)获取目标样品;

(2)从目标样品中提取病毒RNA;

(3)以所提取的病毒RNA为模板,加入通用引物反转录出cDNA;

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