[发明专利]一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用。本发明根据毕赤酵母密码子偏爱性，利用全基因合成方法获得了番木瓜(Carica Papaya)中的几丁质酶编码基因序列，优化后的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步利用毕赤酵母表达系统对该所述优化的几丁质酶编码基因进行高效分泌表达，获得番木瓜几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明获得的番木瓜几丁质酶对低脱乙酰度的壳聚糖底物有较高的水解活性，摇瓶发酵产生的粗酶液即具有1mL(蛋白质含量约0.18mg)降解0.5g壳聚糖的水解能力，而降解相同量的壳聚糖约需要木瓜蛋白酶20mg，理论上效率提高100倍以上；具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于几丁质酶技术领域，具体涉及一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用。

背景技术

几丁质酶(Chitinase，EC.3.2.1.14)广泛存在于古菌、细菌及真核生物中，主要分布在糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases，GH)家族18及19中。在工业上，由于缺乏经济高效的特异性壳聚糖水解酶类(包括几丁质酶及壳聚糖酶)，往往使用蛋白酶及纤维素酶等非特异性商品酶类水解壳聚糖以制备壳寡糖。由于具有壳聚糖水解活性的酶类在这些商品酶中所占比例极低，用酶量较大，壳寡糖的生产成本也相应增加。因此，迫切需要研发出一系列经济高效的壳聚糖水解酶类以满足工业壳寡糖生产的需求。

发明内容

本发明的目的是，提供一种番木瓜几丁质酶及其制备方法和应用；旨在提供一种经济高效的特异性几丁质酶。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

本发明通过对番木瓜几丁质酶(GH19家族)编码基因的密码子进行优化，以利于其在毕赤酵母中实现分泌表达，从而高效快速的获得水解活性高的番木瓜几丁质酶。

本发明提供的一种番木瓜几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本发明还提供了一种番木瓜几丁质酶基因，编码上述的番木瓜几丁质酶。优选地，所述番木瓜几丁质酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

本发明还提供了包含上述番木瓜几丁质酶基因的重组表达载体。优选地，所述表达载体为pGBG1，表达载体pGBG1通过如下方式获得：

通过对表达载体pPIC9中的信号肽序列(详见SEQ ID NO.4所示)进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的新的信号肽序列(详见SEQ ID NO.5所示)，并利用Nsi I/XhoI双酶切将SEQ ID NO.5所示的信号肽序列替代原先的SEQ ID NO. 4所示信号肽，得到表达载体pGBG1。该表达载体pGBG1能够使目的蛋白在毕赤酵母中更高效的分泌表达。

其中，表达载体pPIC9和毕赤酵母细胞GS115均为商业化产品。

本发明所述的番木瓜几丁质酶的制备方法为：将上述的重组表达载体(例如，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的几丁质酶基因构建至表达载体中)导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的几丁质酶。优选地，所述毕赤酵母为GS115。

进一步地，本发明所述番木瓜几丁质酶的具体制备步骤包括：(1)根据毕赤酵母密码子使用的偏好性，对来源于番木瓜的几丁质酶基因原始序列进行密码子优化； (2)将优化后的基因进行全合成并构建至表达载体pGBG1中；(3)对构建的表达载体进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有几丁质酶基因的片段并导入毕赤酵母细胞GS115中，诱导并获得分泌表达的几丁质酶。