[发明专利]流式细胞仪测定染色体端粒长度的方法

权利要求书

1.一种流式细胞仪测定染色体端粒长度的方法，其特征在于，该方法应用于非诊断目的，包括如下步骤：

S1：细胞样品预处理：收集待测细胞的单细胞悬液，洗涤后进行冰浴固定，固定结束后将固定液洗脱，得到待测细胞样品；所述洗脱使用的洗脱液Ⅰ为含有5%小牛血清和0.1%皂苷的磷酸缓冲液；

S2：端粒杂交：向所述待测细胞样品中加入端粒杂交液，在避光条件下进行冰浴，取出后进行高温水浴变性，并在避光、室温条件下进行杂交，得到待测杂交样品；所述端粒杂交液为含有0.3mg/ml端粒探针的杂交缓冲液，所述杂交缓冲液为含有70%去离子甲醛和1%牛血清白蛋白的20mM Tris缓冲液，所述端粒探针的碱基序列如下：

Tel-PNA：FITC-Lys-Lys-CCCTAACCCTAACCCTAA；

S3：洗涤备用：向所述待测杂交样品加入洗脱液进行洗脱，共洗脱三次，弃去洗脱液后加入FACS缓冲液进行悬浮，得到悬浮样品，低温保存备用；

S4：用流式细胞仪对所述悬浮样品进行分析，并计算染色体端粒的长度；

步骤S1中，所述固定液为1%的多聚甲醛；

步骤S1包括如下步骤：

S1.1：收集待测细胞的单细胞悬液，每管细胞数量为5~10*10⁵；

S1.2：向所述单细胞悬液中加入2ml磷酸缓冲液进行洗涤，离心并弃去上清；

S1.3：向沉淀中加入250μl固定液，冰浴放置20min进行固定；

S1.4：向固定的细胞中加入1ml洗脱液Ⅰ进行洗涤，离心并弃去上清，重复上述操作，得到待测细胞样品；

步骤S2包括如下步骤：

S2.1：向所述待测细胞样品中加入1ml杂交缓冲液进行洗涤，离心、弃去上清；

S2.2：向洗涤过的所述待测细胞样品中加入300μl端粒杂交液，在避光条件下冰浴30min，所述端粒杂交液为含有0.3mg/ml端粒探针的杂交缓冲液；

S2.3：将样品从冰浴中取出，置于85~87℃的流动水浴中15min；

S2.4：将样品从水浴中取出，在避光条件下室温放置2h，得到待测杂交样品；

步骤S3包括如下步骤：

S3.1：向所述待测杂交样品中加入1ml洗脱液Ⅱ，室温放置10min，离心并弃去上清，重复上述操作；

S3.2：向沉淀中加入3ml洗脱液Ⅲ，室温放置10min，离心并弃去上清；

S3.3：向沉淀中加入1ml FACS缓冲液进行洗涤，离心并弃去上清；

S3.4：向沉淀中加入200μl FACS缓冲液进行悬浮，得到悬浮样品，低温保存备用；

所述洗脱液Ⅱ为中性的含有70%去离子甲醛的10mM Tris缓冲液；

所述洗脱液Ⅲ为磷酸缓冲液；

所述FACS缓冲液为含有5%小牛血清的磷酸缓冲液；

所述洗脱液Ⅱ和所述洗脱液Ⅲ中均添加有0.1%牛血清白蛋白和0.1%吐温-20。

2.如权利要求1所述的流式细胞仪测定染色体端粒长度的方法，其特征在于，所述步骤S4包括如下步骤：

S4.1：用流式细胞仪对所述悬浮样品进行分析，得到所述悬浮样品中染色体端粒的平均荧光强度；

S4.2：使用荧光量子标准微球制作FITC标记的荧光量子标准曲线；

S4.3：将细胞样品的平均荧光强度转化为等值荧光分子数；

S4.4：根据所述细胞样品染色体端粒的等值荧光分子数，计算染色体端粒长度。