[发明专利]流式细胞仪测定染色体端粒长度的方法

说明书

本发明提供了一种流式细胞仪测定染色体端粒长度的快速方法，在常规的变性杂交步骤前增加一个避光冰浴的操作，让端粒探针有充足的时间进入细胞内部，并且在DNA变形后能快速、有效地与端粒DNA进行杂交，提高杂交的效率和成功率；采用1％的多聚甲醛作为固定液，固定效果更好、更加稳定，使用更加方便；在杂交缓冲液中添加70％去离子甲醛，可以在长时间进行探针杂交时保护细胞结构和DNA的稳定性，以提高杂交的成功率。通过上述改进，使本方法相对于传统测定染色体端粒长度的方法更加快速、精确，适用于长期、大规模的研究工作。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种流式细胞仪测定染色体端粒长度的方法。

背景技术

端粒是短的多重复的非转录序列(TTAGGG)及一些结合蛋白组成特殊结构，除了提供非转录DNA的缓冲物外，它还能保护染色体末端免于融合和退化，在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要作用，并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。当细胞分裂一次，每条染色体的端粒就会逐次变短一些。构成端粒的一部分基因约50～200个核苷酸，会因多次细胞分裂而不能达到完全复制(丢失)，以至细胞终止其功能不再分裂。因此，严重缩短的端粒是细胞老化的信号。在某些需要无限复制循环的细胞中，端粒的长度在每次细胞分裂后，被能合成端粒的特殊性DNA聚合酶-端粒酶所保留。

染色体端粒长度与衰老密切相关，可以作为人体衰老的指标。目前常用的染色体端粒长度的测定方法，主要包括地高辛探针标记的DNA印迹法(Southern blot)、端粒限制性片段(TRF)印迹法和实时定量PCR法。这些方法均具有耗时长、操作繁琐、精确度低等缺陷，不适用于长期大规模的研究工作。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种流式细胞仪测定染色体端粒长度的方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供了一种流式细胞仪测定染色体端粒长度的方法，包括如下步骤：

S1：细胞样品预处理：收集待测细胞的单细胞悬液，洗涤后进行冰浴固定，固定结束后将固定液洗脱，得到待测细胞样品；

S2：端粒杂交：向所述待测细胞样品中加入端粒杂交液，在避光条件下进行冰浴，取出后进行高温水浴变性，并在避光、室温条件下进行杂交，得到待测杂交样品；所述端粒杂交液为含有0.3mg/ml端粒探针的杂交缓冲液，所述端粒探针的碱基序列如下：

Tel-PNA：FITC-dipeptide-CCCTAACCCTAACCCTAA；

本方法在高温水浴变性之前加入一个避光、冰浴的操作，目的是让端粒探针有充足的时间进入细胞内部，并且在DNA变性后能快速、有效地与端粒DNA进行杂交，提高杂交的效率和成功率，同时通过避光避免端粒探针的荧光染料FITC发生降解；荧光染料与端粒分子无法直接连接，因此需要通过一个二肽分子作为连接分子进行连接，本方法中优选为两个赖氨酸(Lys)分子形成的二肽；

S3：洗涤备用：向所述待测杂交样品加入洗脱液进行洗脱，共洗脱三次，弃去洗脱液后加入FACS缓冲液进行悬浮，得到悬浮样品，低温保存备用；

S4：用流式细胞仪对所述悬浮样品进行分析，并计算染色体端粒的长度。

进一步地，所述步骤S1中，所述固定液为1％的多聚甲醛。

1％的多聚甲醛溶液作为固定液，相对于常用的Cytofix/Cytoperm试剂和4％的甲醛溶液来说，固定效果更好、性质更稳定，并且对细胞更加温和，使用更加方便。

进一步地，所述步骤S1中，所述洗脱使用的洗脱液为含有5％小牛血清和0.1％皂苷的磷酸缓冲液。