[发明专利]一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1.脐带间充质干细胞对血管再生微环境影响的实验

1.1人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞增殖的影响

1.2人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞成血管分化的影响

1.2.1Transwell间接共培养

将hUVECs以1*10⁵个/孔接种于六孔板内，待细胞增殖至80％，实验组和对照组分别在Transwell小室以5*10⁵个/孔接种hUCMSCs和hUVECs；经过3天、7天、14天后根据不同实验要求进行不同检测；

1.2.2Western Blot检测ERK1/2和p-ERK1/2

将间接共培养后的hUVECs用冷的PBS洗两次后，加入裂解液+蛋白酶抑制剂并用细胞刮收集，进行7.5％SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上；将膜5％脱脂牛奶封闭2小时，加入小鼠抗ERK1/2和p-ERK1/2一抗，抗小鼠HRP二抗，ECL发光试剂检测；

1.3二维直接共培养观察两种细胞形成的组织结构，不同比例直接共培养两种细胞

步骤2.脐带间充质干细胞和脐带静脉内皮细胞共培养构建微血管网状结构的体外应用研究

2.1水凝胶三维连续微孔道网状阴模培养体系的构建

利用棉花糖机将融化的单糖喷射出的细丝，缠绕形成微米级单糖细丝网结构，将水凝胶液态双组分剂按照1:1的比例混合后，将单糖细丝网浸没于液态组分中，光固化使水凝胶成为半固态；将这一体系置于40℃水域，将单糖细丝溶解，从而形成半固态水凝胶三维连续微孔道网阴模体系；

2.2两种细胞不同比例悬浮灌注共培养构建体外微血管网

将步骤2.1获得三维培养体系置于灌注培养发生器，将hUVECs：hUCMSCs＝1:1、3:1、5:1的比例悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养液，进行灌注培养，流速为5ml/s；4小时更换含有不同比例细胞的培养液，经过3天、7天、14天后4％多聚甲醛固定，组织学切片后根据不同实验要求进行不同检测；

2.3HE染色

组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水，苏木素染色5分钟后冲洗，盐酸酒精分化30秒；伊红染色2分钟后冲洗；通过75％、95％、100％乙醇梯度脱水至蜡；二甲苯透明后中性树胶封固片；

2.4Masson三色染色

组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水；weigert铁苏木素染5-10分，流水稍洗；1％盐酸酒精分化，流水冲洗数分；丽春红酸性品红染液染5-10分，流水稍冲洗；磷钼酸溶液处理5分钟，不用水洗，直接用苯胺蓝染液复染5分钟；1％冰醋酸处理1分钟，95％酒精脱水多次；无水酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封固；

2.5免疫荧光染色

组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水后，进行CD-31、Ⅷ因子和Col-Ⅵ的免疫荧光检测；

步骤3.脐带间充质干细胞和脐带静脉内皮细胞共培养构建的微血管网状结构促进工程化组织再生的体内应用研究

3.1水凝胶三维微血管网阴模复合工程化骨支架材料的构建

利用棉花糖机将融化的单糖喷射出的细丝，缠绕形成微米级单糖细丝网结构，将水凝胶液态双组分剂按照1:1的比例混合后，加入HA/TCP粉末，充分混合均匀；将单糖细丝网浸没于液态组分中，光固化使水凝胶成为半固态；将这一体系置于40℃水域，将单糖细丝溶解，从而形成复合骨支架材料的水凝胶三维连续微孔道阴模体系；

3.2悬浮灌注共培养构建体外微血管网

将hUVECs：hUCMSCs＝1:1、3:1、5:1的比例悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养液，在实验3.1所述培养体系进行灌注培养，流速为5ml/s；4小时更换含有不同比例细胞的培养液，经过3天、7天、14天后，4％多聚甲醛固定，组织学切片后根据不同实验要求进行不同检测；

3.3裸鼠皮下异位实验

选取6周龄雄性裸鼠，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸鼠；将实验3.2中得到的优化策略后的体系作为实验组，实验3.1得到的体系作为对照组分别植入裸鼠皮下，在不同时间点4w，8w，12w取材固定，进行组织切片，后根据不同实验要求进行不同检测；

3.4兔颅骨极限缺损修复原位实验

3.5形态学观察

根据实验2.3、2.4和2.5的步骤分别对实验3.3和3.4取得的组织学切片进行HE染色、Masson三色染色和免疫荧光染色，观察形态学，成血管指标CD-31、Ⅷ因子和Col-Ⅵ以及成骨情况的表达；

3.6Micro-CT检测骨缺损修复

将实验3.4得到的样本于4℃使用4％多聚甲醛固定24小时；Micro-CT扫描取材样本并使用图形软件三维重建分析颅骨缺损的修复情况；t检验进行统计分析。