[发明专利]一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法

说明书

本发明公开了一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法，该方法通过二维共培养不同比例血管内皮细胞和脐带间充质干细胞，研究脐带间充质干细胞促进血管内皮细胞增殖和成血管分化的规律。此外，通过高温熔融的单糖制作微米级网状微血管支架，溶解于水凝胶构建三维水凝胶阴模的连续微孔道培养体系，通过灌注并悬浮培养上述两种细胞，评价其体外构建的微血管网结构以及基于此结构的工程化骨组织体内移植的效果，并阐明其参与并促进微血管网构建的机制。本发明为工程化组织、器官的体外预管化提供新的解决方案以及实验基础。

技术领域

本发明属于医学技术领域，涉及一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法。

背景技术

体外预血管化对于工程化组织、器官体内移植的成功至关重要。基于血管内皮细胞和生物支架材料的血管再生取得了一定进展，但如何在体外构建连续稳定的三维网状微血管系统仍不清楚。近来，研究发现脐带间充质干细胞具有多向分化潜能并能分泌多种促增殖和分化的细胞因子。我们前期的工作表明，脐带间充质干细胞能够参与并促进血管内皮细胞的增殖以及成血管分化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法，该方法通过二维共培养不同比例血管内皮细胞和脐带间充质干细胞，研究脐带间充质干细胞促进血管内皮细胞增殖和成血管分化的规律。此外，通过高温熔融的单糖制作微米级网状微血管支架，溶解于水凝胶构建三维水凝胶阴模的连续微孔道培养体系，通过灌注并悬浮培养上述两种细胞，评价其体外构建的微血管网结构以及基于此结构的工程化骨组织体内移植的效果，并阐明其参与并促进微血管网构建的机制。本发明为工程化组织、器官的体外预管化提供新的解决方案以及实验基础。

利用棉花糖机将融化的单糖喷射出的细丝，制成微米级单糖血管网，而后溶解于半固态水凝胶，形成三维微血管网阴模。在水凝胶体系内悬浮共培养脐带间充质干细胞和血管内皮细胞，同时，在阴模孔道体系灌注共培养上述两种种细胞，通过水凝胶阴模体系构建成血管物理微环境，脐带间充质干细胞构建成血管生物微环境，在体外构建微血管三维网状结构。最后，在动物体内验证这一预成血管化结构对工程化组织移植的促进作用。

其具体技术方案为：

一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法，包括以下步骤：

1.脐带间充质干细胞对血管再生微环境影响的实验

1.1人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞增殖的影响

1.2人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞成血管分化的影响

1.2.1 Transwell间接共培养

将hUVECs以1*105个/孔接种于六孔板内，待细胞增殖至80％，实验组和对照组分别在Transwell小室以5*105个/孔接种hUCMSCs和hUVECs。经过3天、7天、14天后根据不同实验要求进行不同检测。

1.2.2 Western Blot检测ERK1/2和p-ERK1/2

将间接共培养后的hUVECs用冷的PBS洗两次后，加入裂解液+蛋白酶抑制剂(99:1)并用细胞刮收集，进行7.5％SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上。将膜5％脱脂牛奶封闭2小时，加入兔抗ERK1/2和p-ERK1/2一抗，抗小鼠HRP二抗，ECL发光试剂检测。

1.3二维直接共培养观察两种细胞形成的组织结构不同比例直接共培养两种细胞

2.脐带间充质干细胞和脐带静脉内皮细胞共培养构建微血管网状结构的体外应用研究 2.1水凝胶三维连续微孔道网状阴模培养体系的构建