[发明专利]一种GP73 C端抗原的制备及其应用

权利要求书

1.一种GP73 C端蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种制备如权利要求1所述的GP73 C端蛋白的方法，其特征在于，首先，采用PCR方法扩增出编码表达GP73 C端的DNA序列；然后，将该序列插入到表达载体的多克隆位点，构建重组表达质粒；之后，转化到表达宿主菌，构建得到工程菌株，工程菌株经诱导表达；最后，分离纯化得到GP73C端重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种GP73 C端蛋白的制备方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

(1)PCR扩增：采用含BamHI、EcoRI酶切位点的引物PCR扩增GP73C端基因，所述GP73C端基因为从1019～1336bp的基因，酶切纯化后与经BamHI、EcoRI酶切后的PGEX-4T-2质粒连接，转化入大肠杆菌BL21；

(2)确定表达形式：随机挑选阳性克隆，25℃采用1％异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)化学诱导，1％NP-40裂解，-80℃反复冻融3次，离心，取上清和沉淀分别进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，确定表达形式；

(3)扩大培养及纯化：选取阳性克隆进行扩大培养，1％NP-40裂解，-80℃反复冻融3次，采用层析法纯化GP73C端抗原。

4.根据权利要求3所述的一种GP73 C端蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的上游引物为5’-3’：GC GCT GGA TCC CAG CTG GCC TCA，下游引物为5’-3’：GC GAA TTC TGATGTGAG ATGATT。

5.一种应用如权利要求1所述的GP73 C端蛋白制备单克隆抗体方法，其特征在于，用表达合成的GP73C端重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备并筛选杂交瘤细胞株，制备腹水并纯化单克隆抗体。

6.权利要求5中制备得到的单克隆抗体在制备诊断肝脏疾病试剂中的应用。

7.权利要求5中制备得到的单克隆抗体在制备诊断肝脏疾病试剂盒中的应用。

8.如权利要求7中的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的检测过程包括单克隆抗体通过ELISA法检测血清中GP73含量/岩藻糖基化GP73含量的过程。

9.如权利要求7中的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的检测过程包括单克隆抗体通过磁珠化学发光法检测GP73含量试剂盒方面的过程。

10.如权利要求8中的试剂盒，其特征在于，ELISA法检测血清中GP73含量的过程，为用两株针对GP73 C端蛋白不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物显色检测GP73蛋白，通过校准品制备的标准曲线确定GP73蛋白的含量。