[发明专利]一种胞内劳森菌分离方法

权利要求书

1.一种胞内劳森菌分离方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取患有增生性肠炎典型症状的疑似病猪的回肠，用pH为3.0-5.0的PBS溶液进行洗1-3次，刮取回肠黏膜1-10g，置于匀浆器内进行匀浆，再加入2-10 ml细菌分离液中，充分混匀，置于室温环境下5-20min，然后按100-500g离心5-10min，取上清，依次通过5.0、1.2、0.45um滤器进行过滤，滤液置于-20℃保存；

2）取小鼠的肠上皮原代细胞进行贴壁培养；

3）将步骤1）得到的胞内劳森菌分离物用10%FBS的HDMEM细胞培养液按1:5-1:10稀释，加入到汇合度为30%-50%小鼠的肠上皮原代细胞中，之后将细胞瓶置于微需氧产气袋中培养，气体有效浓度为8%-15% O₂、5%-10%CO₂，培养3-5d，每天更换一次新的培养液；

上述的步骤1）中细菌分离液通过以下步骤得到：

取海藻糖1-10 g、磷酸二氢钾0.1-0.5 g、氯化钾0.5-3 g、氯化钠1-8 g、谷胱甘肽5-20mg、亚硒酸钠40-50 umol 、万古霉素50-100 mg、新霉素10-50 ug、两性霉素B 0.5-2 mg；

将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，并且用0.1M的HCL溶液调pH至3.0-5.0，经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用；

上述的步骤2）中小鼠的肠上皮原代细胞进行贴壁培养具体为：

取胚胎期17-19d的胎鼠小肠，去除肠系膜，用PBS溶液清洗5-8次，以洗掉肠内容物和肠黏膜表面的黏液，将肠管剪成0.8-1mm³的组织块，加入5-10 ml 0.25%胰酶消化液进行消化10-20 min，用含有10%FBS细胞培养液终止消化，并吹打均匀，按1000r/min离心8-15min，弃去上清，再用培养液重悬沉淀，移至培养瓶中，置于37℃ 5%的CO₂培养箱中，每30-40h换液一次，最后贴壁的细胞即为小鼠的肠上皮细胞。

2.如权利要求1所述的一种胞内劳森菌分离方法，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤得到：

取氯化钠6-10 g、氯化钾0.05-0.5 g、磷酸氢二钠1-1.2 g、磷酸二氢钾0.1-1g、

氯化钙0.05-0.2 g和含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2 g；

将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，用0.1mol/L的盐酸溶液调至pH值5.0-7.0，再经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。