[发明专利]一种胞内劳森菌分离方法

说明书

一种猪胞内劳森菌的分离培养方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括以下步骤：病料的采集与处理；小鼠的肠上皮原代细胞进行贴壁培养；分离细菌培养。本发明具有以下有益效果：本发明所改变了传统的病料处理方法，省去了以往繁琐的操作步骤，提出了一种新的细菌分离液，大大缩短了细菌的分离时间；提出了应用胎鼠的肠上皮原代细胞用来培养细菌，为胞内劳森菌提供了一个模拟体内的体外培养环境，增加了分离细菌的成功率；应用微需氧产气袋进行培养，解决了价格昂贵的智能多气培养箱的问题，大大降低了细菌分离成本。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种胞内劳森菌的分离方法。

背景技术

胞内劳森菌(LI)是猪增生性肠炎（PPE）的主要病原，LI宿主多而广，能够感染猪、兔、马、仓鼠、大鼠、豚鼠、猴、小鼠等动物，主要寄生在动物的回肠、结肠、盲肠等部位可引起高度增生。目前，PPE呈世界规模流行，感染率高，在国内呈现逐年增加趋势，猪死亡率虽然不高，但严重降低猪对饲料的利用率而提高生产成本，部分感染病猪并不表现出明显的临床症状，呈现隐性感染，生产上容易被忽视，同时该病具有流行性广和危害性大等特点，为了更好的预防和控制PPE，研究LI的分离鉴定就显的非常重要。

LI是一种严格的胞内寄生细菌，而且生存条件要求苛刻，对于LI的分离培养也是一个世界性的难题，常规的培养基难以满足，只能用细胞来分离培养，目前成功分离到的胞内劳森菌不足20株。传统的LI分离方法，步骤多，操作麻烦，分离成功率较低，周期一般较长，鉴于此，我们提出了一种高效、方便、快捷分离LI的方法，对于预防和控制PPE具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明目的在于设计提供一种胞内劳森菌分离方法的技术方案，为胞内劳森菌的诊断及研究提供依据。

所述的一种胞内劳森菌分离方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取患有增生性肠炎典型症状的疑似病猪的回肠，用pH为3.0-5.0的PBS溶液进行洗1-3次，刮取回肠黏膜1-10g，置于匀浆器内进行匀浆，再加入2-10 ml细菌分离液中，充分混匀，置于室温环境下5-20min，然后按100-500g离心5-10min，取上清，依次通过5.0、1.2、0.45um滤器进行过滤，滤液置于-20℃保存；

2）取小鼠的肠上皮原代细胞进行贴壁培养；

3）将步骤1）得到的胞内劳森菌分离物用10%FBS的HDMEM细胞培养液按1:5-1:10稀释，加入到汇合度为30%-50%小鼠的肠上皮原代细胞中，之后将细胞瓶置于微需氧产气袋中培养，气体有效浓度为8%-15% O₂、5%-10%CO₂，培养3-5d，每天更换一次新的培养液。

所述的一种胞内劳森菌分离方法，其特征在于所述的步骤1）中细菌分离液通过以下步骤得到：

取海藻糖1-10 g、磷酸二氢钾0.1-0.5 g、氯化钾0.5-3 g、氯化钠1-8 g、谷胱甘肽5-20 mg、亚硒酸钠40-50 umol 、万古霉素50-100 mg、新霉素10-50 ug、两性霉素B 0.5-2mg；

将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，并且用0.1M的HCL溶液调pH至3.0-5.0，经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

所述的一种胞内劳森菌分离方法，其特征在于所述的步骤2）中小鼠的肠上皮原代细胞进行贴壁培养具体为：