[发明专利]一种同时测定芍药种子中8种内源激素含量的HPLC方法

说明书

本发明提供了一种同时测定芍药种子中多种内源激素含量的HPLC方法，步骤如下：a、制备供试品溶液；b、制备对照品溶液；c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测；d、根据检测结果计算得到芍药种子中的各激素含量。本发明方法可以同时测定芍药种子中8种内源激素，准确可靠、简便快速，为芍药种子的休眠机理研究、促进种子萌发提供了有效的理论依据。

技术领域

本发明属于种子分析技术领域，具体涉及一种同时测定芍药种子中8种内源激素含量的HPLC方法。

背景技术

芍药(Paeonia lactiflora)兼观赏、油用、药用价值于一体，应用广泛，市场需求量大。目前农业生产上生产芍药主要采用块茎繁殖，但容易造成种质退化及药用和繁殖的竞争，而种子繁殖成本低、技术简便、繁殖系数大，能够迅速形成生产力。但由于芍药种子具有独特的上胚轴和下胚轴双休眠萌发特性，对其花期调控、育种工作的进行、种质资源的保护带来诸多不便，对芍药资源的开发利用造成障碍。

迄今为止，芍药种子特殊的双重休眠机理仍不清楚。研究表明，植物休眠由内源激素控制，休眠的起始、终止和调控以及休眠各阶段的变化均受激素调节，是由多种激素之间的平衡所控制。研究种子休眠和萌发过程中内源激素含量的变化规律，有助于研究其休眠的生理原因，为种子解除休眠和促进萌发提供理论依据。

目前对芍药种子中内源激素进行检测时，方法主要有酶联免疫法和高效液相色谱法，但测定的激素种类仅涉及赤霉素、脱落酸等不超过4种，种类较少。考虑到芍药中的有机酸成分众多，仅通过少数几种激素的含量来分析其休眠机理可靠性不高。为了全面分析其休眠机理，有必要对检测激素的种类进行扩展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时测定芍药种子中多种内源激素含量的HPLC方法。

本发明提供了一种同时测定芍药种子中多种内源激素含量的HPLC方法，步骤如下：

a、制备供试品溶液：

取芍药种子粉末，以甲醇为溶剂提取，离心、浓缩，再分别经石油醚、乙酸乙酯萃取，浓缩，用流动相溶解、过滤，得供试品溶液；

b、制备对照品溶液：

取各激素对照品，混合，加乙腈溶解，配制成混合对照品溶液；

c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：流动相A为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序为：0.01～15min，5％～15％B；15～20min，15％～25％B；20～40min，25％～35％B；40～45min，35％～90％B；45～50min，90％B；

检测波长：分别为210nm和254nm；

d、根据检测结果计算得到芍药种子中的各激素含量。

其中，所述内源激素为玉米素、反式玉米素核苷、激动素、赤霉素、吲哚乙酸、水杨酸、脱落酸和/或吲哚丁酸。

其中，步骤a中，以甲醇为溶剂提取的方法为：取芍药种子粉末2重量份，加入体积分数为80％的甲醇溶液5体积份、石英砂0.02重量份及PVPP0.02重量份，研磨后，加入甲醇15体积份，4℃放置24h。

重量份与体积份的对应关系为：g/mL。

PVPP：交联聚乙烯聚吡咯烷酮。

其中，步骤a中，所述离心的条件为4℃，10000r/min离心10min。