[发明专利]一种香蕉束顶病毒侵染性克隆及构建方法

说明书

本发明公开了一种香蕉束顶病毒侵染性克隆及构建方法。该侵染性克隆包含BBTV各组分的8个过环全长重组质粒，分别为pDNA‑R，pDNA‑U3，pDNA‑S，pDNA‑M，pDNA‑C，pDNA‑N，pSat4，pS2。通过转化大肠杆菌，或通过转化农杆菌后瞬时注射烟草叶片，发生同源重组进而产生≧2×大小病毒片段的重组质粒，且在香蕉体内重组为病毒并引发香蕉病变。本发明在国内外首次报道了BBTV侵染性克隆的构建，实现了BBTV侵染性克隆从无到有的过程，填补了国内外该领域的空白，为下一步BBTV蛋白基因功能、基因重组、致病机理及构建基因沉默载体等研究提供基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种香蕉束顶病毒侵染性克隆及构建方法。

背景技术

香蕉束顶病(Banana bunchy top disease,BBTD)严重威胁着世界香蕉产业的生产，包括中国南方各省。BBTD是由香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)引起，主要靠虫媒香蕉蕉脉蚜(Pentalonia nigronervosa)和香蕉种苗传播。香蕉束顶病毒属矮缩病毒科(Nanoviridae)的香蕉束顶病毒属(Babuvirus)，其基因组至少由6个环状的单链DNA组分所组成，分别包裹在病毒颗粒中。除DNA-U3组分外，其他组分均编码病毒功能蛋白，DNA-R编码复制起始蛋白(replication initiation protein,Rep)，DNA-S编码外壳蛋白(capsid protein,CP)，DNA-M编码运动蛋白(movement protein,MP)，DNA-C编码细胞周期调控蛋白(cell-cycle link protein,Clink)，DNA-N编码核穿梭蛋白(nuclear shuttlepr otein,NSP)。另外，卫星组分(Satellite molecular)作为病毒复制和侵染的非必须组分，已在部分分离物中被发现和报道，其编码辅助复制起始蛋白(assistant replicationinitiation pr otein,RepA)。目前，中国周边国家(东南亚地区)仍在流行BBTD，给我国香蕉种植业带来潜在的巨大风险。

病毒重组主要以序列同源性(同源臂)为基础，将目的基因整合到病毒基因组中的基因工程技术。重组病毒的构建是建立在体外同源重组的基础上，筛选一个含亲本毒株的复制片段，通过质粒转移载体与病毒基因组DNA之间的同源重组，从而将外源基因导入病毒基因组中。病毒重组即留了亲本毒株的生物学特性，又可使重组病毒得到复制增殖。目前，该技术已广泛应用于多种类型的病毒重组，如腺病毒(Adenovirus,Adv)、猪伪狂犬病毒(Pseu dorabies virus,PrV)、痘病毒(Poxvirus,FPV)和杆状病毒(Baculovirus)等。

研究表明，多个BBTV基因组序列已分离和报道，但是在改造该病毒以及研究如何减弱其致病过程等研究尚未起步，且病毒各基因功能等方面研究也需进一步鉴定。目前，多组分环状病毒侵染性克隆构建难度较大，关键技术之一是需要合成或构建多倍性(大于病毒各组分长度1倍及以上)的过环片段，且国内外尚无BBTV侵染性克隆的相关报道。

本发明构建的BBTV病毒侵染性克隆，可在细菌或植物体内同源重组，继而进一步产生比野生型BBTV病毒各组分环状片段大1倍的侵染性DNA克隆重组质粒，从而成功感染香蕉宿主。利用分子生物学技术和方法构建BBTV侵染性克隆，为研究BBTV复制和侵染机理，病毒蛋白基因功能，病毒与寄住互作，以及防治BBTD提供重要研究基础。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供了一种香蕉束顶病毒侵染性克隆，该克隆包括8个重组质粒，包括pDNA-R、pDNA-U3，pDNA-S，pDNA-M，pDNA-C，pDNA-N，pSat4和pS2。

本发明的另一个目的在于提供了一种香蕉束顶病毒侵染性克隆的构建方法，方法简单。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：