[发明专利]一种纯合转基因油菜的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因品种领域，尤其涉及一种纯合转基因油菜的制备方法。

背景技术

目前获得纯合转基因油菜主要有两种途径，一是直接以二倍体油菜为对象，对种子或愈伤组织进行农杆菌侵染转基因，之后对转基因第一代植株进行自交，收获转基因第二代植株，进而不断筛选出纯合转基因植株；二是先通过小孢子培养技术获得单倍体油菜，再对单倍体植株进行转基因，之后通过秋水仙素等化学加倍法对单倍体进行染色体加倍即通过人工染色体加倍，从而获得纯合的转基因植株(如图1所示)。第一种方法耗费大量的时间，至少需要2个世代才能获得目标植株，有些甚至需要多自交几个世代才能获得目标转基因的纯合后代，第二种方法首先需要得到单倍体，而小孢子培养技术操作复杂、费时费力，且成功率较低，秋水仙素等加倍剂毒性大且容易导致嵌合体的产生。

因而，现有的获得转基因纯合后代普遍存在的问题是：方法操作繁琐，不能够一步到位。主要原因有：转基因对象多为杂合二倍体，转入的基因常为单拷贝且为杂合状态，需要至少经过1个世代的自交才能得到纯合转基因后代，且自交得到纯合转基因植株的效率不能达100％，想要得到数量较多的目标转基因个体则至少还需要增加一个生育期，这就导致了试验效率大大降低。或者，小孢子培养操作复杂，单倍体获得率低，染色体加倍剂毒性大，化学加倍率不高，容易得到倍性嵌合体。

因此，急需提供一种新的操作简便、周期短、诱导率高，毒性低的纯合转基因油菜的制备方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备纯合转基因油菜的方法，其制备操作简便、周期短、诱导率高。

为实现上述目的，本发明提供了一种纯合转基因油菜的制备方法，其制备过程包括下述步骤：

供体油菜的选择；

花序浸染法浸染供体油菜；

双单倍体诱导系技术对供体油菜进行后代诱导纯合；

种子收集；

转基因油菜筛选。

本发明通过花序浸染法对供体浸染，将目标转基因转到供体的雌配子中(即仅含有卵细胞)而非易产生不育的雄配子或受精后的合子中，再利用双单倍体诱导系技术，通过受精后诱导系染色体组丢失和母本雌配子染色体组自发加倍，从而获得纯合的双单倍体，即将转基因和基因纯合紧密联系在一起，通过双单倍体诱导系的刺激，使被转基因的母本雌配子基因组发生自发加倍，省去了耗时的自交时间，避免了组织培养及化学加倍等环节，大大加快了育种进程，并通过一系列的转基因油菜筛选步骤确保转基因后代的纯合性和血统的纯正。

进一步的，供体油菜的选择步骤包括选择初花期前的油菜。选择健壮植株上的主花序和第一次分株，选择3-5天后即将开放的花蕾，此发育时期的油菜浸染转化成功率较高，因为大量研究表明农杆菌是在心皮闭合之前进入子房室的。

进一步的，所述花序浸染法浸染供体油菜步骤包括将供体油菜的花序浸染在农杆菌菌液中。具体为将油菜花序浸染在农杆菌菌液中2～5min，套袋保持24小时的避光，连续浸染3～4次，每次间隔24小时。根据油菜花序发育情况，在农杆菌浸染前后进行去雄处理，用人工去雄或者机械化去雄仅留有雌蕊油菜进行后续花粉授粉。

进一步的，所述双单倍体诱导系技术对供体油菜进行后代诱导纯合步骤包括收集双单倍体诱导系的油菜花粉，将油菜花粉涂抹在所述花序浸染法浸染供体油菜的柱头上，并进行套袋处理。具体为收集双单倍体诱导系的油菜花粉，将油菜花粉涂抹在所述花序浸染法浸染供体油菜的柱头上，授粉后套袋处理，防止与其他花粉交叉污染。重复授粉3～4次，以保证诱导充分获得纯合双单倍体。待花期结束后，去掉花粉纸袋。双单倍体诱导系技术可采用八倍体供体给四倍体授粉、四倍体对二倍体授粉、二倍体对单倍体授粉，优选为八倍体对四倍体授粉，其能得到只含有母本基因组的纯合后代。

油菜种类包括甘蓝型油菜，白菜型油菜和芥菜型油菜，优选采用甘蓝型油菜作为授粉对象，因为甘蓝型油菜的花序中间花蕾着生位置高于开放花朵，开花时花药一般内向开裂或半内向开裂，在进行花序浸染时，比较容易将目标转基因转到供体的雌配子中而非易产生不育的雄配子或受精后的合子中，同时甘蓝型油菜自交亲和性强，自交结实率高，更加激发了双单倍体诱导系效果，大大加快了育种进程。

进一步的，所述转基因油菜筛选步骤包括抗生素鉴定、PCR鉴定、倍性鉴定、分子纯合性鉴定而进行油菜植株筛选。