[发明专利]胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法

权利要求书

1.一种胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法，其包括如下步骤：

（1）样品制备步骤：将含有胡椒碱代谢产物的生物样品的清液上装有反相填料的固相萃取柱，依次采用水和甲醇作为洗脱剂进行洗脱，分别得到水洗脱液和甲醇洗脱液，并收集甲醇洗脱液；将所述甲醇洗脱液挥干，残渣用溶剂溶解，离心，得到样品溶液；所述的反相填料为C18；所述含有胡椒碱代谢产物的生物样品选自哺乳动物灌服胡椒碱后的血浆、尿液或粪便中的一种或多种；

（2）检测步骤：将所述样品溶液采用超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱质谱法进行检测分析，检测条件包括：

色谱条件：色谱柱：反相色谱柱,所述的反相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相A为0.1vol%甲酸水溶液, 流动相B为乙腈与甲醇体积比为3:1的有机溶剂；梯度洗脱条件：0→2 min，5vol% B；2→3 min，5→10vol% B；3→17 min，10→30vol% B；17→28 min，30→60vol% B；28→30 min，60→80vol% B；30→35 min，80vol% B；柱温为30℃；进样体积为2 µL；流速为300 µL/min；

质谱条件：电喷雾离子源负离子检测模式，毛细管电压30V，喷雾电压3.0kV，毛细管温度350℃，鞘气30arb，辅助气10arb；采用傅里叶变换进行全扫描和母离子列表扫描，一级分辨率为30 000，扫描范围m/z 100-1 000；二级质谱采用数据依赖扫描，扫描分辨率为15000，选取上一级丰度最高的至少一个离子峰进行碎片裂解，激活时间30ms，归一化碰撞能量：70%；数据采集系统为Xcalibur 2.1，得到总离子流色谱图;

所述检测方法还包括如下步骤：

（3）胡椒碱代谢产物的筛选步骤：应用高分辨提取离子流法和质量亏损过滤法从质谱检测数据中进行筛选，得到胡椒碱代谢产物的提取离子流色谱图；

（4）胡椒碱代谢产物的分子预测步骤：采用Xcalibur 2.1工作站分子式预测模块，对提取离子流色谱图中的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C：10-25，H ：20-40，O ：0-15，S ：0-4，N ：0-4，Cl ：0-4，环和不饱和双键数：0-15，质量精度误差在5 ppm以内。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括如下步骤：

（5）胡椒碱代谢产物结构鉴定步骤：对胡椒碱代谢产物的质谱裂解碎片离子进行分析，确定其动态诊断离子和中性丢失，通过反向拼装，对胡椒碱代谢产物的结构进行鉴定。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述清液与所述固相萃取柱中的反相填料的重量比为1:2-10。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述水的用量为所述清液体积的 1-8 倍；所述甲醇的用量为所述清液体积的 1-5倍。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述甲醇洗脱液挥干的方法为N₂吹干；所述残渣用溶剂溶解的方法为涡旋震荡溶解；所述离心方法为8000-14000rpm下离心5-20min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述溶剂选自甲醇、乙腈、5-95vol%的乙腈水溶液、5-95vol%的甲醇水溶液。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述装有反相填料的固相萃取柱提前进行活化处理，所述活化处理方法为：首先采用甲醇进行活化，然后用水进行平衡。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述反相色谱柱选自如下型号的反相色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 ：1.7 µm，2.1×100 mm、ACQUITY UPLC BEHC18 ：1.7 µm，2.1×50 mm、ACQUITY UPLC T3 C18：1.8 µm，2.1×50 mm、 ACQUITY UPLC T3C18 ：1.8 µm，2.1×100 mm。