[发明专利]胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法

说明书

本发明公开了一种胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法，其包括：(1)样品制备步骤：将含有胡椒碱代谢产物的生物样品匀浆，得到清液；将所述清液上装有反相填料的固相萃取柱，依次采用水和甲醇作为洗脱剂进行洗脱，分别得到水洗脱液和甲醇洗脱液，并收集甲醇洗脱液；将所述甲醇洗脱液挥干，残渣用溶剂溶解，离心，得到样品溶液；(2)检测步骤：将所述样品溶液采用高效液相色谱‑质谱联用法进行检测分析，得到总离子流色谱图。本发明的检测方法灵敏度高，特异性强。

技术领域

本发明涉及一种胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法。

背景技术

胡椒碱(Piperine)，化学名(E，E)-1-[5-(1，3-苯并二氧戊环-5-基)-1-氧代-2，4-戊二烯基]-哌啶，其分子式为C₁₇H₁₉NO₃，分子量为285.34。胡椒碱为白色晶体粉末，熔点130～133℃，溶于乙酸、苯、乙醇和氯仿，微溶于乙醚。现代研究证实，胡椒碱具有较强的抗炎、抗氧化、抗惊厥等作用。例如，胡椒碱在150mg·kg^-1剂量下有明显的对抗戊四唑惊厥作用，使惊厥率显著降低。在100、150mg·kg^-1剂量下均有对抗电惊厥的作用，且对大鼠的“听源性发作”均有明显对抗作用。同时，胡椒碱有明显的镇静作用，能减少小鼠的自发性活动，对硫喷妥钠有协同作用，剂量依赖性地延长苯巴比妥钠催眠时间，能使苯巴比妥的血药浓度维持在高水平。由此可见，胡椒碱具有很好的药物开发前景。

胡椒碱的体内药代动力学/药效学是当前国内外的热点之一。关于胡椒碱原形的测定方法有很多，例如纸层析法、薄层色谱法、可见-紫外分光光度法、反相高效液相色谱法等。胡椒碱在动物体内被代谢后，其原形成分以及代谢产物的浓度均很低，一般在微克甚至纳克级别，常见的检测方法很难实现这些成分的检测。

利用现代技术分析对胡椒碱在动物体内的代谢产物进行检测，对于确定胡椒碱在体内的直接作用物质，并真实地反映其药效物质基础，进而对胡椒碱及其类似物进行有效利用，具有重要意义。例如，给Wistar大鼠按170mg·kg^-1剂量灌胃胡椒碱，采用薄层扫描法检测发现，其可以被代谢为胡椒基酸、胡椒醇、胡椒醛和香草酸[Toxicology，1986，40(1)：83-92]。近年来，液质联用技术由于兼顾了液相色谱的分离度和质谱检测器的高灵敏度和高专属性，已经被逐步应用于药物代谢产物的研究中。例如，给Sprague-Dawley大鼠按170mg·kg^-1剂量灌胃胡椒碱，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱进行检测，检测到了大鼠体内的12个代谢产物[Rapid Communications in Mass Spectrometry，2017，31(11)：901-910]。由此可见，这些胡椒碱代谢产物检测方法所检测到的胡椒碱代谢产物的数量和类别均较少，不能充分阐述胡椒碱的体内代谢形式，制约了胡椒碱的体内代谢机理的研究及其进一步的临床应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱质谱(UHPLC-LTQ-Orbitrap)的胡椒碱代谢产物检测方法，该方法灵敏度高，特异性强，能够更全面地阐明胡椒碱的体内的代谢产物。

本发明提供一种胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法，其包括如下步骤：

(1)样品制备步骤：将含有胡椒碱代谢产物的生物样品的清液上装有反相填料的固相萃取柱，依次采用水和甲醇作为洗脱剂进行洗脱，分别得到水洗脱液和甲醇洗脱液，并收集甲醇洗脱液；将所述甲醇洗脱液挥干，残渣用溶剂溶解，离心，得到样品溶液；

(2)检测步骤：将所述样品溶液采用超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱质谱联用法进行检测分析，检测条件包括：