[发明专利]一种快速检测土壤中病原微生物的方法

权利要求书

1.一种环境检测方法，其特征在于，包括利用环介导等温扩增定性检测靶标微生物的存在，所述微生物为土传病原微生物，所述土传病原微生物为病毒和细菌，所述病毒为大麦黄花叶病毒，所述细菌为立枯丝核菌、腐霉菌和黄萎轮枝孢菌，所述方法包括：

步骤1、提取获得环境中土壤微生物总DNA序列；

步骤2、按如下反应体系扩增土壤微生物总DNA样品：

步骤3、于55℃反应3分钟，之后于95℃反应5分钟，冷却至常温，在产物中加入PicoGreen，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变；

步骤4、所述引物用于检测大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、腐霉菌以及黄萎轮枝孢菌，所述引物包括：

大麦黄花叶病毒BYMV：

BYMV-BIP：5-GATTGTCCGTGGCTCTGGCTC-GTCT CAAGGGGCGAATC-3

BYMV-FIP：5-TCCGATACGAGGTGCGGC-GTTT CCCAGAAGGGCTACC-3

BYMV-B3：5-GGCTTTGTCAGGCGATCGTAGC-3

BYMV-F3：5-GCATCGTAGCTCGAAGCTAGCTAG-3

立枯丝核菌Rhi:

Rhi-BIP：5-AATTCGTCCGTAGGAATCGAT-GTGG GTGTCCGTAGCGT-3

Rhi-FIP：5-CAGCGTAGGTTAACGTAC-TTGT AGCTGTCGTCCACAAC-3

Rhi-B3：5-GCGGTGTCAGTATCTAGGATC-3

Rhi-F3：5-TCTAGCGTAGCCGGTAGATCGTACTT-3

腐霉菌Pyt：

Pyt-BIP：5-GCGAATCGACATCGTTAACGTAG-TGGT TCGGAGCCCTAAGAG-3

Pyt-FIP：5-TACTAGGAACTCTCAAATCT-TTGG CGAATCGGGCGTAAGTCG-3

Pyt-B3：5-CCTTGAGAGAATCGTGTACGTGCCTA-3

Pyt-F3：5-TCGGTAACGTAGCAGTAGTCGGTAGC-3

黄萎轮枝孢Ver：

Ver-BIP：5-TGCCAAATCGGTATCAATCCAGACT-TTGG GCTACTCGGTCGAT-3

Ver-FIP：5-GCTACGTCCTAGCTGTTCGTC-GTGG CCCAGTGATTTTGAGTT-3

Ver-B3：5-GTGGTGAAGCCTAGCTAGGTCAGTAG-3

Ver-F3：5-CCTATCATGGGACAGCAGCGGGAC-3

所述方法为一种以土壤为样本通过LAMP快速检测技术同时检测出大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、腐霉菌以及黄萎轮枝孢菌四种土传病原菌的方法。

2.根据权利要求1所述的环境检测方法，其特征在于，所述产物量通过肉眼观测浑浊度判定，如存在阳性产物则反应液呈现浑浊状态，如不存在阳性产物则反应液澄清。