[发明专利]一种快速检测土壤中病原微生物的方法

说明书

本发明涉及环境微生物及分子生物学领域，尤其涉及一种利用环介导恒温扩增检测土壤中病原微生物存在的方法。本发明方法包括环介导恒温扩增引物的获得、DNA的提取和扩增、所检测微生物的种类的判定。本发明实现了对土传病原微生物的高效、快速、定性检测，无需PCR扩增即可通过肉眼判断靶标微生物的存在。本发明适用于环境检测、食品检测、病原菌检测等领域。

技术领域

本发明涉及环境检测领域，更具体地涉及土壤微生物检测领域，特别地涉及一种快速检测土壤中病原微生物的方法。

背景技术

土壤中存在数量巨大、种类繁多的微生物，它们中的绝大部分是有益的，在土壤发育、物质转化、结构形成、提高作物养分有效性、抑制病原菌活性等方面发挥着不可替代的作用。但是土壤中也存在着另一类引起作物病害的有害微生物，通称为土传病原微生物(soil-borne pathogens)。由生活在土壤中或残留在土壤的病株残体中的病菌引起的作物病害统称为土传病(soil-borne diseases)。

日前，在节能温室中栽培的瓜类、茄果类、豆类等蔬菜上已经发现的病害有100多种，经常发生、危害比较严重的有50余种，在这些病害当中，除黄瓜霜霉病等极少数病害是借助气流和人们的农事活动从温室外面传入外，而绝大多数真菌性、细菌性病害和部分病毒性病害，其病菌都是在土壤中或借助病残体在土壤中越冬。这些病害的初次侵染，几乎都是来自温室内的土壤。

防治土传病害，必须严格执行“以防为主、综合防治”的植保方针，以减少温室土壤菌源为首要目的，所以土传病原菌的快速检测及鉴定对于防治土传病害有至关重要的作用。

本发明提供一种快速检测土壤环境中土传病原菌的方法，具有特异性强、灵敏度高、恒温、操作简单和检测结果快速读取等优点。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种环境检测方法，包括利用环介导等温扩增定性检测靶标微生物的存在。

进一步地，所述微生物为土传病原微生物，所述土传病原微生物包括但不限于病毒和细菌，所述病毒为大麦黄花叶病毒，所述细菌包括但不限于立枯丝核菌、镰刀菌、腐霉菌和黄萎轮枝孢菌。

更进一步地，所述环境检测方法检测环境中土壤微生物的具体步骤为：

步骤1、提取获得环境中土壤微生物总DNA序列；

步骤2、按如下反应体系扩增土壤微生物总DNA样品：

双蒸水补足至20μL；

步骤3、于55℃反应3分钟，之后于95℃反应5分钟，冷却至常温，在产物中加入PicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,USA)，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变；

步骤4、所述引物用于检测大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、镰刀菌、腐霉菌以及黄萎轮枝孢菌。

优选的，所述产物量可以通过肉眼观测浑浊度判定，如存在靶标微生物则反应液呈现浑浊状态，如不存在靶标微生物则反应液澄清。

进一步地，所述反应体系为：

双蒸水补足至50μL。

优选地，所述总DNA样品包括但不限于大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、镰刀菌、腐霉菌和黄萎轮枝孢菌的脱氧核糖核苷酸序列。