[发明专利]一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法

权利要求书

1.一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，具体包括以下步骤：

1)将烟叶样品，采用三氯乙酸-丙酮沉淀法、苯酚法分别提取蛋白，再将蛋白合并后复溶，获得蛋白样品溶液；

2)将步骤1)所得蛋白样品溶液进行酶解、脱盐、干燥，获得肽段干粉作为试样；

3)将步骤2)中制备的试样进行二维液相色谱质谱联用法检测，依次通过第一维液相色谱、第二维液相色谱进行捕集后洗脱分离，再由质谱进行检测；

所述复溶采用的溶剂为4-8M尿素水溶液；所述蛋白样品溶液中，所述复溶采用的溶剂加入的体积与蛋白的质量之比为55-65：1，μl/mg；

步骤2)中，所述酶解过程为：取蛋白样品溶液，依次加入二硫苏糖醇溶液、碘乙酰胺溶液进行反应后，转移至超滤管中加入碳酸氢铵溶液进行超滤离心，再加入胰蛋白酶进行反应后补加胰蛋白酶继续反应，将反应产物离心后，收集获得肽段溶液；

步骤2)中，所述脱盐是将酶解后获得的肽段溶液过C18固相萃取柱进行脱盐；所述干燥为冻干，所述冻干的温度为≤-80℃；

步骤3)中，所述第一维液相色谱的条件为：第一维液相色谱系统：Aquity UPLC系统；第一维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱；第一维液相色谱柱：XBridge反相液相色谱柱；柱温：室温；流速：150-250μl/min；进样量：5-20μl；第一维流动相A相：15-25mM甲酸铵水溶液，pH＝9-11；第一维流动相B相：15-25mM甲酸铵+85-95v/v％乙腈水溶液，pH＝9-11；检测波长：210-220nm；梯度洗脱；

所述第一维液相色谱的梯度洗脱的具体程序为：

0-40min，A相：B相体积比为95：5-65：35；

40-41min，A相：B相体积比为65：35-95：5；

41-56min，A相：B相体积比为95：5-95：5；

步骤3)中，所述第二维液相色谱的条件为：第二维液相色谱系统：Nano Aquity UPLC系统；第二维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱；第二维液相色谱柱：Acclaim PepMapC18纳升级反相色谱柱；上样流速：5-15μl/min；上样时间：2-4min；进样量：6-10μl；柱温：35-45℃；流速：250-350nL/min；第二维流动相A相：4-6v/v％乙腈+0.05-0.15v/v％甲酸水溶液，pH＝2-3；第二维流动相B相：85-95v/v％乙腈+0.05-0.15v/v％甲酸水溶液，pH＝2-3；梯度洗脱；

所述第二维液相色谱的梯度洗脱的具体程序为：

0-45min，A相：B相体积比为98：2-60：40；

45-45min，A相：B相体积比为60：40-98：2；

45-60min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

2.根据权利要求1所述的一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，其特征在于，步骤1)中，所述蛋白样品溶液采用紫外分光光度法进行定量，包括以下步骤：

A)将蛋白样品溶液，加入沉淀剂进行旋转混悬后离心，取沉淀物加入溶解剂进行旋转混悬后溶解，再加入显色剂混合后，进行孵育反应，即得待测样品溶液；

B)取一系列不同浓度的蛋白标准溶液，采用与步骤A)相同的处理过程，即得一系列不同浓度的待测标准溶液；

C)将步骤A)中获得的待测样品溶液和步骤B)中获得的待测标准溶液，添加入试剂盒，采用紫外分光光度法进行吸光度测定，采用标准曲线法进行定量，获得蛋白样品溶液中蛋白的含量。

3.根据权利要求2所述的一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，其特征在于，步骤A)中，包括以下条件中任一项或多项：

A1)所述沉淀剂为预冷后的三氯乙酸-丙酮溶液，所述三氯乙酸-丙酮溶液的预冷温度不大于5℃；

A2)所述溶解剂包括有溶解液和水，所述溶解液、水与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为9-11:39-41:1；所述溶解液为含有0.05-0.2wt％十二烷基硫酸钠的4-8M尿素水溶液；

A3)所述显色剂为BCA蛋白定量试剂盒中配备的显色剂。